使用方法

1）细胞样品制备：细胞数量控制在1×10⁵~1 × 10⁶个。

a）贴壁细胞：小心吸除细胞培养液，用胰酶消化细胞，制备成单细胞悬液。1000 g离心5 min，沉淀细胞，弃上清，用1 mL预冷的PBS润洗细胞一次，离心收集细胞。

b）悬浮细胞：1000 g离心5 min，沉淀细胞，小心吸除上清。加入1 mL预冷的PBS，重悬细胞，再次离心收集细胞。

c）组织细胞：将组织块用剪刀剪成尽量小的小块后，用0.25%的胰酶消化0.5-1 h，经过200-400目筛网过滤得到单细胞悬液。1000 g离心5 min，沉淀细胞。加入约1 mL预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。

2）细胞固定：细胞沉淀用1 mL预冷的70%乙醇轻轻混匀，4℃固定2 h以上或者过夜。接下来1000 g，离心5 min沉淀细

胞后，用1 mL预冷的PBS重悬。然后再次1000 g离心5 min沉淀细胞。

3）染色：

在0.5 mL染色缓冲液(40301-C)中加入10 μL 碘化丙啶储液（40301-B）和10 μLRNase A（40301-A）溶液，混匀待用。每个细胞样品加入0.5 mL配置好的碘化丙啶染色液，轻轻混匀重悬细胞。37℃避光孵育30 min，就可以进行流式检测，流式检测最好在5 h内完成。

【注】：配置好的PI染色液在短时间内可以4℃保存，宜当日使用。

4.流式检测和分析：细胞用400目筛网过滤，用流式细胞仪进行检测，在激发波长488 nm波长处检测，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

HB221122

Q：这款试剂盒是不是凋亡和周期均可以检测？

A：这款试剂盒是检测细胞周期的，细胞周期检测中细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，根据DNA含量的分布情况，进行细胞周期和细胞凋亡分析。

Q：Staining Solution能否使用PBS或DPBS代替？

A：可以

Q：流式周期结果如何分析？G1,S，G2-M数据分析。G2/G1的数据是有意义吗？

A：一般是G1期数据都基本没有变化，抑制细胞周期的药物处理就是G2/M期增加，S期减少。一般是看各个时期的比值

Q：流式周期固定的时候能否直接加70-75%的乙醇重悬细胞固定？

A：不可以，如果直接用70-75%的乙醇，会导致固定效果差或者出现细胞固定后无沉淀的现象。建议先用PBS重悬细胞后，再加入无水乙醇稀释到70-75%。

Q：做流式周期的时候，只出现单峰是什么原因？是不是你们的试剂有问题？

A：试剂是没有问题的，能出现峰说明试剂是可以和核酸结合的，只出现单峰或没有G2期，可能原因有以下几点：1.细胞状态，是不是细胞状态较差，建议调整细胞状态之后进行实验。2.细胞密度过密，如果细胞接种的时候过密会导致细胞接触抑制。3.原代细胞，有些原代细胞是没有增值能力的。4.圈门没圈好，建议正确圈门

Q：流式分析细胞周期，收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还可以看到细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现看不到细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？

A：1. 先用冷PBS悬浮细胞，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入预冷的无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

2.很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：采用尖底的离心管和水平离心机。离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时残留1mm左右的水膜，不要吸完。离心的转速或时间可稍微增加一点儿。每次加溶液时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

Q：试剂盒的 RNase A和 PI的浓度是多少，Staining Solution成分是什么？

A:RNase A和 PI的浓度都是1mg/ml，Staining Solution成分是一些盐溶液配方，配方不告知，用完了可以暂用PBS替代。

Q：周期的各个时期加起来不足100%是什么原因呢？

A：应该是没调好，因为流式是一个动态的过程，首位有点偏差是正常的，差的大可能是圈了一些黏连的细胞，需要去掉这些细胞，或者选择不同的拟合公式，可以调整圈门看看。

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产品描述

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit）采用了经典的碘化丙啶染色(Propidium staining，即PI staining)方法对细胞周期与细胞凋亡进行分析。

碘化丙啶 (Propidium，PI) 是一种双链DNA荧光染料，其嵌入双链DNA后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，根据DNA含量的分布情况，进行细胞周期和细胞凋亡分析。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化 (DNA fragmentation) 导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞PI染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。

细胞凋亡也可以用流式细胞仪观察细胞光散射的变化来检测。 细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化。凋亡前期，染色质皱缩，细胞密度增加，前向角光散射色显著降低。凋亡后期，细胞产生凋亡小体，前向角光散射和侧向角光散色都显著降低。

本试剂盒通常应用于贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测。如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化成单细胞状态，才可以进行检测。

产品组分

运输与保存方法

运输：冰袋（wet ice）运输。

保存方法：-20℃避光保存，有效期为2年。

【注】如果需要在短时间内多次重复使用，可以于4℃避光保存，2个月内有效。

注意事项

1）本试剂盒需要使用流式细胞仪进行检测。

2）细胞处理需轻柔，尽量避免人为的损伤细胞。

3）为防止不同批次细胞在实验时所处周期不同导致重复性差，可以在实验前进行细胞的同步化处理。实验细胞应处于对数

生长期，贴壁细胞一般在50～80%汇合度时收集为宜。

4）400目筛网过滤是用来将粘在一起的细胞团滤掉，留下单细胞，否则会出现人为的多倍体干扰。如果没有条件过滤，请在染色之前将细胞轻弹以分散，再进行染色。

5）荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6）操作碘化丙啶时，应注意防护，保护眼睛、避免吸入。

7）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

8) 本产品仅作科研用途！

取出试剂并回温至室温，吸取50 µLDMSO溶解1管Calcein AM，混匀后避光保存。

【注】：钙黄绿素一旦溶解后，建议设置一系列实验将其短时间内用完，不能长期保存钙黄绿素溶液。

2、 细胞染色（流式分析）

1）用本试剂盒含有的Cell Stain Buffer将细胞制备成单细胞悬液，使其密度为1×10⁶细胞/mL。

【注】：① 用于离子霉素对照样品的缓冲液必须含有Ca²⁺；

       ② 钙黄绿素加载时不能含有血清；

       ③ 细胞必须为单细胞悬液。

2）按照1ml每管将细胞悬液等分，每个样品等分成3份。

后续染色顺序：1号管仅含钙黄绿素，2号管含钙黄绿素和CoCl₂，3号管含钙黄绿素，CoCl₂和离子霉素，另外准备一管不含试剂的细胞样品用于相应的仪器设置。

3）用Cell Stain Buffer 1:500稀释1 mM Calcein AM储存液，制备成2 µM的工作液，例如取5 µL 1mM储存液加入2.5 mL Cell Stain Buffer，混匀即可。

4）向上述每个样品的3管中分别加入5 µLCalcein AM工作液并混匀。

5）向2号、3号管中加入5µl CoCl₂，并混匀。

6）向3号管中加入5 µLIonomycin(100µM)，并混匀。

7）在37℃避光孵育15 min。

8）向每管中加入3.5 mLCell Stain Buffer，离心收集细胞。

【注】：此步可去除多余染料以及可能引起荧光淬灭的试剂。

9）用400 µL同时可用于流式检测的合适的缓冲液重悬细胞团。

如果需要，也可进行进一步染色。如用标记的Annexin V 检测磷酯酰丝氨酸易位；用PI 检测细胞活力；或者用MitoTracker红色探针检测线粒体活力等。注意整个过程均需避光操作。

10）染色后，将样品置于冰上，1 h内进行流式分析。

11）用不含试剂的细胞样品进行相应的仪器设置。用流式488激发器进行荧光分析，Calcein AM最大激发波长494 nm，最大发射波长517 nm。

1号管-仅含钙黄绿素：线粒体和胞浆有荧光，荧光信号较强；

2号管-含钙黄绿素和CoCl₂：仅线粒体呈现荧光，荧光强度居中；

3号管-含钙黄绿素，CoCl₂和离子霉素：线粒体和胞浆荧光均被淬灭，荧光信号最弱。

2号管和3号管荧光信号的变化说明线粒体通透性转换孔被不断的激活。

HB230308

[1] Li S, Hao M, Li B, et al. CACNA1H downregulation induces skeletal muscle atrophy involving endoplasmic reticulum stress activation and autophagy flux blockade. Cell Death Dis. 2020;11(4):279. Published 2020 Apr 24. doi:10.1038/s41419-020-2484-2(IF:6.304)
[2] Kang L, Liu S, Li J, Tian Y, Xue Y, Liu X. The mitochondria-targeted anti-oxidant MitoQ protects against intervertebral disc degeneration by ameliorating mitochondrial dysfunction and redox imbalance. Cell Prolif. 2020;53(3):e12779. doi:10.1111/cpr.12779(IF:5.753)
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[5] Ma Q, Xu Y, Tang L, et al. Astragalus Polysaccharide Attenuates Cisplatin-Induced Acute Kidney Injury by Suppressing Oxidative Damage and Mitochondrial Dysfunction. Biomed Res Int. 2020;2020:2851349. Published 2020 Jan 3. doi:10.1155/2020/2851349(IF:2.276)

产品描述

线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP），又称线粒体巨型通道（magachannel），是存在于线粒体内外膜之间的非选择性高导电性通道，由多种蛋白质复合组成。线粒体通透性转换孔 (mPTP)可能参与了细胞死亡过程中线粒体成分的释放。

正常的细胞线粒体内膜可维持正常的线粒体电位梯度以保证细胞呼吸作用及能量供应，随着Ca²⁺的摄入和释放，一种低电导渗透性转换孔在张开和闭合中来回切换。当细胞发生凋亡时和病理性死亡时，线粒体膜电位转换孔渗透性发生改变，Ca²⁺的过载，线粒体谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后继细胞色素C的释放，线粒体膜电位下降等都会导致线粒体渗透性转换孔的激活。

线粒体膜通透性转换孔检测试剂盒（流式分析）检测方法是一种相对于仅基于线粒体膜电位分析更直接的检测线粒体通透性转换孔开放的检测方法。其原理是：首先通过被动运输加载Calcein AM，后者是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透活细胞膜，被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein，从而被滞留在细胞内，使胞质包括线粒体发出强绿色荧光。加入CoCl₂后，来自胞质的荧光被CoCl₂淬灭，仅留下线粒体内的荧光。作为对照，可将细胞加载Calcein AM和CoCl₂的同时，对其用离子霉素处理，从而使细胞加载更多的Ca²⁺，引起线粒体通透性转换孔的激活从而使线粒体荧光淬灭。

本试剂盒以1ml标记体系计算，可供100次检测。检测最大激发波长494 nm，最大发射波长517 nm。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃避光干燥保存，避免反复冻融，有效期至少6个月。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！

使用方法

为了达到最佳实验效果，需针对不同的细胞类型、细胞培养条件等进行调整优化。本品还可配套其他探针一起操作。

1、 1mM Calcein AM储存液制备

产品描述

鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

动态浊度法内毒素检测鲎试剂（Kinetic Turbidimetric LAL Assays）是通过检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度来检测内毒素的方法。在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。随着凝胶的形成，反应液的吸光度(OD值，浊度)增加，OD值增加的速度与内毒素浓度成正相关。换言之，OD值上升某一预设限值(启动OD)所需要的时间(定义为启动时间)与内毒素浓度成负相关，启动时间的对数与内毒素浓度的对数成线性关系，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。4℃避光保存，有效期2年。

注意事项

1. 该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。

2. 接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的。试验过程应防止微生物的污染。

3. 该说明书中的除热原指内毒素浓度小于 0.005 EU/mL。

4. 供试品的 pH 值应在 6.0-8.0 之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1 M 氢氧化钠或 0.1 M 盐酸调节。

5. 当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。

6. 本产品仅作科研用途！

所需材料和设备

1. 试剂：内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水。

2. 器材：

除热原试管、除热原吸头、除热原加样槽、除热原96孔微板。

旋涡混合器、移液器、多道移液器、试管架。

带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪ELx808及软件TALgent 或Gen5。

操作方法

1. 动态光度测定仪器的设定，以微板鲎试仪ELx808为例：

预热仪器，设置温育温度为37℃，设置模板及程序。设定读板波长为340 nm、630 nm，设定动力学参数：读板90-120分钟， 每读板间隔30-150 s。

2. 内毒素标准溶液配制

2.1 标准曲线所采用的内毒素浓度可以为2至10倍稀释的系列(如0.5，0.25，0.125，0.0625 EU/mL 或10，1，0.1，0.01 EU/mL))。

2.2 取内毒素工作标准品1支，用砂轮沿安瓿颈部划痕，开启，加入适量（建议在0.5 mL-1.2 mL之间）细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇5分钟。

2.3 将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成所需浓度，每稀释一步均应在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟。稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟，配置时间超过4小时的内毒素溶液应丢弃。(参见《内毒素工作标准品使用说明书》)。

3. 阴性对照为细菌内毒素检查用水。

4. 鲎试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解。注意不要用旋涡混合器剧烈

振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内使用。若采用多道移液器，将溶解的鲎试剂转移到除热原加样槽，并轻轻摇匀。

5. 实验操作（微板鲎试仪ELx808）：

5.1 取除热原微板，在各孔中分别加入100 μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。

5.2 将微板放置于鲎试仪中，37℃温育10分钟。

5.3 温育结束，用移液器或多道移液器加入100 μL 鲎试剂（避免产生气泡!)，中速振摇10 秒混匀，在340 nm波长处，每30秒（到60秒）读一次，读板120分钟。

数据处理

设定启动OD(可以设为0.02, 一般可以在0.02到0.04之间)，软件自动给出其启动时间(T)。

建立标准曲线：lgT = b lgC + a，其中T为启动时间，C为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。

当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：

1. 标准曲线的浓度点≥ 3，标准曲线的相关系数r ≤ -0.980，

2. 标准曲线最低点的T值小于阴性对照的T值，

3. 供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。

【供试品的干扰试验】

1. 当对新药或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，必须进行干扰试验；

2. 当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变，或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，必须重新进

行干扰试验；

3. 当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验。

4. 步骤如下：

4.1 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度，如采用标准曲线为10，1，0.1，0.01 EU/mL 系列时, 可以用供试品配制0.1 EU/mL 内毒素浓度作为实验的供试品阳性对照。

4.2 用供试品溶液配制浓度为λm 的内毒素溶液（即含λm 内毒素的供试品阳性对照），测量出该溶液的内毒素浓度，称为Cs；

4.3 测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度，称为Ct；

4.4 计算该试验条件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm × 100%

4.5 当R在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在明显干扰作用。

4.6 当R在50%～200%之外，需对供试品进行系列稀释或进行其它处理消除干扰, 每一稀释溶液都重复步骤2-4, 直到内毒素的回收率R在50%～200%之间。选择回收率R最接近100%的稀释倍数进行内毒素检测。

(参见《中华人民共和国药典》2020 版中《细菌内毒素检查法》)

HB220607

[1] Li J, Qin X, Shi J, et al. A systematic CRISPR screen reveals an IL-20/IL20RA-mediated immune crosstalk to prevent the ovarian cancer metastasis. Elife. 2021;10:e66222. Published 2021 Jun 11. doi:10.7554/eLife.66222(IF:8.146)
[2] Li H, Li J, Shi H, et al. Structural characterization and immunoregulatory activity of a novel acidic polysaccharide from Scapharca subcrenata. Int J Biol Macromol. 2022;210:439-454. doi:10.1016/j.ijbiomac.2022.04.204(IF:6.953)
[3] Ni J, Chen H, Zhang C, et al. Characterization of Alpinia officinarum Hance polysaccharide and its immune modulatory activity in mice. Food Funct. 2022;13(4):2228-2237. Published 2022 Feb 21. doi:10.1039/d1fo03949k(IF:5.396)