2×实时定量PCR扩增预混液|Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

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2×实时定量PCR扩增预混液|Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有高灵敏度和高特异性的特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

 

运输和保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

 

注意事项

1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11141ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。   

4. 本产品仅作科研用途！

 

反应体系

组分

体积（μL）

体积（μL）

终浓度

Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

模板DNA

X

X

–

无菌超纯水

to 50

to 20

–

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20-30个循环为好。     

d) 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

标准程序                                         快速程序

循环步骤

温度

时间

循环数

 

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

2 min

1

 

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

 

变性

95℃

3 sec

40

退火/延伸

60℃

30 sec★

 

退火/延伸

60℃

20 sec★

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

 

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

【注】 快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

a) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

b) 荧光信号采集（★）：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

c) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

 

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

 

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

 

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

 

引物设计指南

1. 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3. 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

 

适用机型

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus; 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;  

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler;

Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR. 

HB221205

Q：建议qPCR 实验用几步法？

A：常用 2 步法。需提高扩增特异性，可选用 2 步法或提高退火温度。在扩增效率低， ct 值过大的时候，可以改用 3 步法或延长延伸时间。

Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A：有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为  –3—3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率–1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无 Ct 值。（3）熔解曲线：为单一峰。

Ct 值大于 15 个循环是因为 3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

Q：11184 的灵敏度极限是?

A：单拷贝

Q：同一基因复孔间熔解曲线 Tm 值有差异？

A：同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。

Q：为什么稀释了模板CT 值反而变小了？

A：一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT 值变低。

Q：内参CT 值小于 20，目的基因均大于 30，怎么办？

A:可能是目的基因为低丰度表达基因导致。建议：a）换用内参；b）换引物

 

 Q：为什么扩增曲线杂乱且不连续？

A：可能原因是 ROX 添加不当。确认参比染料ROX 是否添加正确。

Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A：(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在  20-30  之间的最佳上样量。
(2)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。

Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A：a)有效性要满足三个条件：
（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3–3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。
（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。
（3） 熔解曲线：为单一峰。

  b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

  Q：Rox 的作用？

  A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

  Q: 为什么扩增产物跑胶会有拖尾的现象？

  A: 试剂中本身含有稳定性成分，本身不参与任何反应，所以产物中还是有稳定剂成分的，这个稳定剂成分在电泳胶上面会表现出弥散状，不建议跑完后再电泳。

  Q: 试剂比较粘稠，容易产生气泡，如何避免？

  A: 可以先混合大体系，再分别加到离心管里面，最后加模板；

  枪头加样不要把空气打进去，二档吸样，一档打样品；缓慢推出液体，不要吹打；沿着壁打入到孔内；

  另外配置完后，如果还有气泡，离心PCR管去除。如果是96孔板，移液完后轻轻敲96孔板。

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Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有高灵敏度和高特异性的特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

 

运输和保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

 

注意事项

1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11141ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。   

4. 本产品仅作科研用途！

 

反应体系

组分

体积（μL）

体积（μL）

终浓度

Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

模板DNA

X

X

–

无菌超纯水

to 50

to 20

–

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20-30个循环为好。     

d) 反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

标准程序                                         快速程序

循环步骤

温度

时间

循环数

 

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

2 min

1

 

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

 

变性

95℃

3 sec

40

退火/延伸

60℃

30 sec★

 

退火/延伸

60℃

20 sec★

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

 

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

【注】 快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

a) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

b) 荧光信号采集（★）：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

c) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

 

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

 

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

 

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

 

引物设计指南

1. 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3. 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

 

适用机型

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus; 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;  

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler;

Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR. 

HB221205

Q：建议qPCR 实验用几步法？

A：常用 2 步法。需提高扩增特异性，可选用 2 步法或提高退火温度。在扩增效率低， ct 值过大的时候，可以改用 3 步法或延长延伸时间。

Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A：有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为  –3—3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率–1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无 Ct 值。（3）熔解曲线：为单一峰。

Ct 值大于 15 个循环是因为 3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

Q：11184 的灵敏度极限是?

A：单拷贝

Q：同一基因复孔间熔解曲线 Tm 值有差异？

A：同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。

Q：为什么稀释了模板CT 值反而变小了？

A：一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT 值变低。

Q：内参CT 值小于 20，目的基因均大于 30，怎么办？

A:可能是目的基因为低丰度表达基因导致。建议：a）换用内参；b）换引物

 

 Q：为什么扩增曲线杂乱且不连续？

A：可能原因是 ROX 添加不当。确认参比染料ROX 是否添加正确。

Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A：(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在  20-30  之间的最佳上样量。
(2)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。

Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A：a)有效性要满足三个条件：
（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3–3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。
（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。
（3） 熔解曲线：为单一峰。

  b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

  Q：Rox 的作用？

  A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

  Q: 为什么扩增产物跑胶会有拖尾的现象？

  A: 试剂中本身含有稳定性成分，本身不参与任何反应，所以产物中还是有稳定剂成分的，这个稳定剂成分在电泳胶上面会表现出弥散状，不建议跑完后再电泳。

  Q: 试剂比较粘稠，容易产生气泡，如何避免？

  A: 可以先混合大体系，再分别加到离心管里面，最后加模板；

  枪头加样不要把空气打进去，二档吸样，一档打样品；缓慢推出液体，不要吹打；沿着壁打入到孔内；

  另外配置完后，如果还有气泡，离心PCR管去除。如果是96孔板，移液完后轻轻敲96孔板。

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