许多生化反应，例如ATP水解、DNA和RNA聚合、腺苷酸环化酶形成的环AMP和脂肪酸的酶促活化以形成它们的辅酶A酯，都能产生焦磷酸盐(PPi)，PPi能被无机焦磷酸酶水解。翌圣焦磷酸(PPi)荧光检测试剂盒采用最可靠的焦磷酸盐分光光度测定方法，使用专有的荧光PPi感受器(Ex/Em=316/456 nm)测定样本PPi的含量，相对于传统的酶偶联方法更简单、更稳定，是筛选酶活性或酶抑制剂的理想方法。

该试剂盒已经成功用于高通量筛选，适用于多种样本，如：尿液、血清、血浆、细胞培养提取物、组织裂解物等。

该试剂盒不提供试用装。

 

产品组分

组分编号	组分名称	组分规格
50115-A	Assay Buffer	25 mL×1
50115-B	PPi Sensor (Lyophilized)	1 vial
50115-C	Pyrophosphate Standard	1 mL×1, 50 mM
50115–D	DMSO	200 μL×1

 

运输和保存方法

冰袋运输。-25~-15℃避光保存，有效期2年。

 

注意事项

1. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3. 粉末溶解前请先短暂离心，以保证产品全在管底。
4. 请勿吸入、吞咽或者直接接触皮肤和眼睛。
5. 本产品仅用于科研用途。

 

实验过程

1、试剂准备

① 200× PPi Sensor母液：将50 μL DMSO（D组分）加入PPi Sensor (Lyophilized)（B组分）中制备200× PPi Sensor母液，分装-20°C避光保存，避免反复冻融。25 µL 200× PPi Sensor母液足以用于一块96孔板。

② PPi标准液(1 mM)：向10 μL的50 mM焦磷酸盐标准溶液（C组分）加入490 μL ddH₂O或50 mM Hepes缓冲液(pH 7)，得到1 mM PPi标准溶液。

③ PPi标准液(PS7 – PS1)：向50 μL的1mM焦磷酸盐标准溶液加入450 μL ddH₂O或50 mM Hepes缓冲液(pH 7)，得到100 μM PPi标准溶液(PS7)。取100 μM PPi标准溶液，用ddH₂O或50 mM Hepes缓冲液(pH 7)进行1：3连续稀释，得到连续稀释的焦磷酸盐标准品(PS6-PS1)。

④ PPi Sensor工作液：25 μL的200× PPi Sensor母液加入5 mL的Assay Buffer（组分A，用前恢复至室温），充分混合以制备PPi工作液。

【注】：由于该检测方法对PPi具有高灵敏度，因此必须使用不含PPi的实验室器具和试剂。DTT ≥ 1 mM会增加背景，MgCl₂ ≥ 2 mM会抑制反应。

2. 根据表1和2中提供的布局向黑色96孔板中加入50 μL PPi标准品(PS)、空白对照品(BL, Assay buffer only)或测试样本(TS)。对于384孔板，每孔加入25 μL。

【注】：尿液、血清和血浆样品应在1/250-1/5000的范围内稀释后再进行检测，具体稀释倍数根据具体实验情况而定。

Table 1. Layout of Pyrophosphate standards and test samples in a solid black 96-well microplate.

BL	BL	TS	TS
PS1	PS1	…	…
PS2	PS2
PS3	PS3
PS4	PS4
PS5	PS5
PS6	PS6
PS7	PS7

PS = Pyrophosphate Standard (PS1 – PS7, 0.13 to 100 µM), BL = Blank Control, TS = Test Sample.

 

Table 2. Reagent composition for each well.

Well	Volume	Reagent
PS1 – PS7	50 μL	Serial Dilutions (0.13 to 100 µM)
BL	50 μL	Assay Buffer
TS	50 μL	Test sample

3. 对于96孔板，每孔加入50 μL PPi Sensor工作液，总测定体积为100 μL/孔；对于384孔板，每孔加入25 μL PPi工作液，总测定体积为50 μL/孔。
4. 混匀后，室温孵育10-30 min。
5. 荧光酶标仪下测量荧光读值，Ex/Em = 316/456 nm (Cutoff = 420 nm)。

 

数据分析

从空白标准孔获得的读数用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。该方程可以用于计算样本中PPi含量。

【注】：荧光背景会随时间而增加，因此标准品和测试样本的荧光读值计算前需减去空白孔的荧光强度值。

图1 代表性PPi标准曲线

HB230221

 

Q：探针只与PPi结合吗？

A：探针会和一些其它物质结合，如ATP或一些和PPi结构相近的，但亲和力不强。所以在选择配置样本的buffer要谨慎选择，建议一般是HEPJP溶液。

Q：如果缓冲液中有大于2 mM的MgCl₂，抑制的是哪部分反应？

A：Mg²⁺会抑制PPi和探针的结合。

Q：如何保证实验器具和试剂不含PPi？

A：实验器具清洗干净就可以，或者使用一次性实验器具。

Q：如果样本体系中本身含有大于1 mM DTT和大于2 mM的MgCl2，可以将体系稀释后再进行检测吗？

A：体系可以稀释，但是同时要注意谨慎选择稀释液，并且稀释后样本中PPi浓度不要太低，要在检测范围之内。

Q：血浆和血清都可以检测吗？

A：血清和血浆都可以用，但血浆中含有EDTA，如果EDTA> 30 μM会影响探针和PPi结合效率。

Q：RIPA裂解液提取的样本能用这个试剂盒吗？

A：SDS、Tween-20和EDTA (> 30 μM)都会影响探针和PPi结合，而RIPA裂解液中含有SDS，故不适合。

Q：样本裂解液中TritonX-100的浓度多少合适？

A：TritonX-100的浓度可以达到1%。

Q：细胞和组织样本如何处理？

A：可以使用HEPJP溶液或者HBSS进行匀浆，离心后取上清进行检测。细胞样本也可以使用温和裂解液，但裂解液中不能含有SDS、Tween-20或其它影响探针和PPi结合的物质。

Q：试剂盒PPi的检测范围是多少？

A：0.1-10 μM。

Q：为什么做出来的标曲和说明书上的不一样？

A：实验室需做复孔，注意复孔数据是否一致，去除差异大的数据；作图时横坐标取PPi浓度的log10值；

Q: 想请问一下，这标准曲线的纵坐标就是荧光酶标仪示数减去空白示数吗。还有最终得到的标曲应该是线性的还是像咱们网站上一样是非线性的呢? 还有这个%of control是指什么?

A: 1.标准曲线的纵坐标就是荧光酶标仪示数减去空白示数；2.这个试剂盒得到的标准曲线应该是非线性的，因为PPi Sensor与PPi的结合是一个饱和过程，当PPi的浓度越高时，荧光强度的增加越小。3. 图中的% of control是指每个样品的荧光强度与空白对照的百分比，用于表示样品中PPi的相对含量。空白对照是只加入试剂盒中的缓冲液和PPi Sensor，不加入任何样品或标准品。

Q：说明书写的是1：3进行稀释，PS7-PS1的浓度时0.13-100uM，是怎么稀释的呢？

A：三倍稀释，比如1：100稀释，是稀释100倍，1：3稀释是稀释3倍，PS7-PS1浓度分别是：100uM，33.33uM，11.11uM，3.7uM，1.23uM，0.41uM，0.13uM。

Q：cutoff是必须的嘛？

A：不是必须的，建议有条件的话，cutoff是要设置的，cutoff值是指荧光检测仪器的滤波器设置，用于减少背景信号和提高信噪比。不设置，可能会影响您对实验结果的判断，如果您是初次使用这类试剂盒或初次进行这类检测，该值的设置，是结果准确性判断的直接有效的方法。

Q：酶标仪将检测结果自动减去了420nm 处的吸光值吗？

A：就是测316/456的同时，再设置一个316/420，cutoff值作为对照去看，不参与计算，检测值高于cutoff值说明是阳性的，低于这个值就是阴性的。

Q：焦磷酸试剂盒可以检测大肠杆菌提取的蛋白样品吗？

A：可以

Q：这个试剂盒检测一定要用黑色的酶标板吗？

A：黑色孔板可以减少光的散射和反射，提高荧光信号的灵敏度和准确度。有条件的话，建议使用黑色的。其他的也可以，但是可能会影响荧光强度。