A尾法miRNA第一链cDNA反转录试剂盒|miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

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A尾法miRNA第一链cDNA反转录试剂盒|miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22 nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用加A尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3'末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。后续qPCR中只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。此外，试剂盒中提供了人、大鼠、小鼠通用的 U6 内参上下游引物，可在宽广的区域内得到良好的标准曲线。

本产品推荐与本公司的Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat#11171）配套使用，以获得最优的实验结果。

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

11148ES10(10 T)

11148ES50(50 T)

11148-A

Hifair® miRNA RT enzyme mix

17.5 μL

87.5 μL

11148-B

2×Hifair® miRNA RT buffer

50 μL

250 μL

11148-C

RNase-free H2O

2 mL

10 mL

11148-D

Universal Reverse Primer (10 μM)

800 μL

4 mL

11148-E

U6 Forward Primer (10 μM)

100 μL

500 μL

11148-F

U6 Reverse Primer (10 μM)

100 μL

500 μL

 

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

 

操作步骤

一、体系配制

室温融化Hifair® miRNA RT enzyme mix和2×Hifair® miRNA RT buffer后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配置反应体系：

组分

体积 (μL)

终浓度

2×Hifair® miRNA RT buffer

5

1×

Hifair® miRNA RT enzyme mix

1.75

–

RNA*

–

X

RNase-free H2O

Up to 10

–

*总RNA及提取的miRNA的浓度范围10 pg-2 μg，合成的miRNA拷贝数最低可达60 copies，投入体积不超过3.25 μL。

 

二、逆转录程序

移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应：

反应温度

反应时间

备注

37℃

50 min

miRNA加A尾及反转录过程

85℃

5 sec

酶失活过程

【注】：逆转录产物可直接进行下游qPCR检测。为避免逆转录体系对qPCR反应的抑制，可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-20℃保存。若长期保存，建议分装后，于-80°C保存，避免反复冻融。

 

注意事项

1）使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。

2）实验时，请使用无RNase污染的耗材，避免不必要的损失影响实验结果。

3）本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

HB221202

Q: 试剂盒中的下游通用引物序列是什么？

A: 下游通用引物是保密的。当前市面上常见到的加A法反转录试剂中，加上的带A序列是不一样的，均是根据自己的加尾酶设计并完善的，出于专利保护所以不做公开。

Q: 试剂中的U6引物和通用反向引物是干什么用的？
A: U6是miRNA的内参，提供的引物可用于后续荧光定量检测。
通用反向引物可以让您后续qPCR中，只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。
Q: 后续做荧光定量，必须搭配11171ES吗？可以用普通的荧光定量试剂吗？
A: 市面上常见的普通荧光定量大多只能满足80-300bp的片段，短片段的扩增不了。专门的miRNA 荧光定量试剂可以保证短片段产物的合成。

[1] Huang G, Chen J, Liu J, Zhang X, Duan H, Fang Q. MiR-935/HIF1α Feedback Loop Inhibits the Proliferation and Invasiveness of Glioma. Onco Targets Ther. 2020;13:10817-10828. Published 2020 Oct 23. doi:10.2147/OTT.S244409(IF:4.147)
[2] Li H, Pan R, Lu Q, et al. MicroRNA‑145‑5p inhibits osteosarcoma cell proliferation by targeting E2F transcription factor 3. Int J Mol Med. 2020;45(5):1317-1326. doi:10.3892/ijmm.2020.4504(IF:4.101)

microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22 nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用加A尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3'末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。后续qPCR中只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。此外，试剂盒中提供了人、大鼠、小鼠通用的 U6 内参上下游引物，可在宽广的区域内得到良好的标准曲线。

本产品推荐与本公司的Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat#11171）配套使用，以获得最优的实验结果。

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

11148ES10(10 T)

11148ES50(50 T)

11148-A

Hifair® miRNA RT enzyme mix

17.5 μL

87.5 μL

11148-B

2×Hifair® miRNA RT buffer

50 μL

250 μL

11148-C

RNase-free H2O

2 mL

10 mL

11148-D

Universal Reverse Primer (10 μM)

800 μL

4 mL

11148-E

U6 Forward Primer (10 μM)

100 μL

500 μL

11148-F

U6 Reverse Primer (10 μM)

100 μL

500 μL

 

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

 

操作步骤

一、体系配制

室温融化Hifair® miRNA RT enzyme mix和2×Hifair® miRNA RT buffer后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配置反应体系：

组分

体积 (μL)

终浓度

2×Hifair® miRNA RT buffer

5

1×

Hifair® miRNA RT enzyme mix

1.75

–

RNA*

–

X

RNase-free H2O

Up to 10

–

*总RNA及提取的miRNA的浓度范围10 pg-2 μg，合成的miRNA拷贝数最低可达60 copies，投入体积不超过3.25 μL。

 

二、逆转录程序

移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应：

反应温度

反应时间

备注

37℃

50 min

miRNA加A尾及反转录过程

85℃

5 sec

酶失活过程

【注】：逆转录产物可直接进行下游qPCR检测。为避免逆转录体系对qPCR反应的抑制，可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-20℃保存。若长期保存，建议分装后，于-80°C保存，避免反复冻融。

 

注意事项

1）使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。

2）实验时，请使用无RNase污染的耗材，避免不必要的损失影响实验结果。

3）本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

HB221202

Q: 试剂盒中的下游通用引物序列是什么？

A: 下游通用引物是保密的。当前市面上常见到的加A法反转录试剂中，加上的带A序列是不一样的，均是根据自己的加尾酶设计并完善的，出于专利保护所以不做公开。

Q: 试剂中的U6引物和通用反向引物是干什么用的？
A: U6是miRNA的内参，提供的引物可用于后续荧光定量检测。
通用反向引物可以让您后续qPCR中，只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。
Q: 后续做荧光定量，必须搭配11171ES吗？可以用普通的荧光定量试剂吗？
A: 市面上常见的普通荧光定量大多只能满足80-300bp的片段，短片段的扩增不了。专门的miRNA 荧光定量试剂可以保证短片段产物的合成。

[1] Huang G, Chen J, Liu J, Zhang X, Duan H, Fang Q. MiR-935/HIF1α Feedback Loop Inhibits the Proliferation and Invasiveness of Glioma. Onco Targets Ther. 2020;13:10817-10828. Published 2020 Oct 23. doi:10.2147/OTT.S244409(IF:4.147)
[2] Li H, Pan R, Lu Q, et al. MicroRNA‑145‑5p inhibits osteosarcoma cell proliferation by targeting E2F transcription factor 3. Int J Mol Med. 2020;45(5):1317-1326. doi:10.3892/ijmm.2020.4504(IF:4.101)