Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2是用于Illumina®/MGI®测序平台的DNA&RNA共建库试剂盒，包含高效cDNA合成试剂，酶切建库试剂。与传统的建库法比较，本产品可以DNA&RNA一管式建库，一步高效完成cDNA合成，同时采用高质量的片段化酶，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，肿瘤样本，复杂样本，同时能兼容FFPE 样本的建库。该试剂盒使用了最新优化的连接酶，改善了接头连接时的片段自连现象，同时替换了新型高保真酶，进一步提升了扩增的均一性和保真性。
本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品组分
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组分编号和名称
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12305ES08
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12305ES24
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12305ES96
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12305-A
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Random Primer
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20 μL
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60 μL
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240 μL
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12305-B
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cDNA Reaction Buffer
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64 μL
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192 μL
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768 μL
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12305-C
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cDNA Enzyme Mix
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16 μL
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48 μL
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192 μL
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12305-D
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Smearase Buffer
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80 μL
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240 μL
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960 μL
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12305-E
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Smearase Enzyme Mix
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40 μL
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120 μL
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480 μL
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12305-F
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Ligation Enhancer
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240 μL
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720 μL
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2×1440 μL
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12305-G
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Novel T4 DNA Ligase
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40 μL
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120 μL
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480 μL
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12305-H
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2×Super Canace® II High-Fidelity Mix
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200 μL
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600 μL
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2×1200 μL
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*
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Primer Mix*
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40 μL
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120 μL
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480 μL
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注：*标注表示该成分不包含在本试剂盒，需要额外配置，本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，但需要额外配置专属于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat# 13334 Primer Mix for MGI®以及Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®)
运输与保存方法
干冰运输。-20℃保存。有效期1年。
注意事项
一．关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
6. 本产品仅作科研用途！
二、关于接头连接 (Adapter Ligation)
1. 本公司可提供Illumina®或者MGI®长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。
2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。
4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。
表1-1 Input Total DNA&RNA量与Illumina®接头使用浓度推荐表
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Input Total DNA&RNA
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Illumina® Adapter stock concentration
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<10 ng
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3 μM
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≥10 ng
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15 μM
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表1-2 Input Total DNA&RNA量与MGI®接头使用浓度推荐表
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Input Total DNA&RNA
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MGI® Adapter stock concentration
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<10 ng
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5 μM
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≥10 ng
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10 μM
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*可根据不同类型total DNA&RNA样本及投入量，按需求适当调整Adapter使用量。
三、关于文库扩增（Library Amplification）
文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1 mg文库的推荐循环数。
表2 Input Total DNA&RNA与扩增循环数推荐表*
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Input Total DNA&RNA
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Number of cycles
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<1 ng
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10~12
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1 ng
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9~10
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10 ng
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6~7
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50 ng
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4~5
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100~1000 ng
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4
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【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。
四、DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。
五、关于文库质检（Library Quality Analysis）
1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
六、自备材料（Other Material）
1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure® XP Beads（A63880）或其他等效产品。
2.Adapter：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效产品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效产品）。
3. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
4. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
建库流程图
使用方法
Step 1 RNA变性
- 将 Random Primer 室温解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。按照表3配置反应液：
表3 RNA预变性反应体系
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名称
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体积（μL）
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|
Random Primer
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2.5
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DNA&RNA（1 ng-1 ug）
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32.5
|
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Total
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35
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- 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
- 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表4所示设置反应程序，进行RNA的预变性。
表4 RNA预变性反应程序
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温度
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时间
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热盖 75°C
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On
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70°C
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5 min
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立即置于冰上
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3 min
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Step 2 cDNA 的合成（cDNA Synthesis）
1. 将cDNA合成试剂从-20°C取出，室温解冻，颠倒混匀后瞬离。按表5所示，配制cDNA合成的反应液。
表5 cDNA合成反应体系
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名称
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体积（μL）
|
|
变性的DNA&RNA
|
35
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cDNA Reaction Buffer
|
8
|
|
cDNA Enzyme Mix
|
2
|
|
Total
|
45
|
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表6所示设置反应程序，进行cDNA的合成。
表6 cDNA合成反应程序
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温度
|
时间
|
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热盖 105°C
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On
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25°C
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5 min
|
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42°C
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20 min
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85°C
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5 min
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4°C
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Hold
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Step 3 cDNA片段化/末端修复/dA尾添加（cDNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）
该步骤将cDNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。
- 将表7中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
- 于冰上配制表7反应体系。
表7 cDNA片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应体系
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名称
|
体积（μL）
|
|
cDNA
|
45
|
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Smearase Buffer
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10
|
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Smearase Enzyme Mix
|
5
|
|
Total
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60
|
3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表8所示反应程序，进行cDNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。
表8 cDNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序
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温度
|
时间
|
|
热盖105°C
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on
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4°C
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1 min*
|
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30°C
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5-15 min**
|
|
72°C
|
20 min
|
|
4°C
|
Hold
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【注】：*cDNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4°C，待模块温度降至4°C时，将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表9。
表9 片段化时间选择表
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插入片段主峰大小
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片段化时间
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150~200 bp
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5~15 min
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Step 4 接头连接（Adapter Ligation）
该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina®或者MGI®接头。
1. 参考注意事项二中的表1，根据Input DNA&RNA量，稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表10中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3. 于Step 3步骤结束后的PCR管中继续配制表10所示反应体系。
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名称
|
体积（μL）
|
|
dA-tailed DNA
|
60
|
|
Ligation Enhancer
|
30*
|
|
Novel T4 DNA Ligase
|
5
|
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DNA Adapter
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5**
|
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Total
|
100
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表10 Adapter Ligation体系
【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
**本公司illumina接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1-1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。
**本公司MGI接头原始浓度为10 μM, 请根据注意事项二表1-2的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。
4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表11所示反应程序，进行接头连接反应：
表11 Adapter Ligation反应程序
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温度
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时间
|
|
热盖Off
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–
|
|
20°C
|
15 min
|
|
4°C
|
Hold
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Step 5连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.45×，Beads:DNA=0.45:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。
Step 6文库扩增（Library Amplification）
该步骤将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表12中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表12所示反应体系。
表12-A illumina短接头连接产物PCR反应体系 表12-B illumina长接头连接产物PCR反应体系
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组分名称
|
体积 (μL)
|
组分名称
|
体积 (μL)
|
|
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix
|
25
|
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix
|
25
|
|
Universal Primer/ i5 Primer*
|
2.5
|
Primer Mix**
|
5
|
|
Index Primer/ i7 Primer*
|
2.5
|
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Adapter Ligated DNA
|
20
|
Adapter Ligated DNA
|
20
|
|
Total
|
50
|
Total
|
50
|
【注】：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂 (Cat#12414-12415)中配备的Index primer进行扩增。**如果您使用的是Indexed Adapter (Cat#13519-13520)，俗称长接头（大Y接头），可用Cat#13335中的Hieff NGS® Primer Mix for Illumina®进行扩增。
表12-C MGI接头连接产物PCR反应体系
|
组分名称
|
体积（μL）
|
|
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix
|
25
|
|
Primer Mix for MGI®*
|
5
|
|
Adapter Ligated DNA
|
20
|
【注】：*该primer mix for MGI不含在本试剂盒中，可用Cat#13334中的Hieff NGS® Primer Mix for MGI®进行扩增。
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
- 将PCR管置于PCR仪中，设置表13示反应程序，进行PCR扩增。
表13 PCR扩增反应程序
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温度
|
时间
|
循环数
|
|
98°C
|
1 min
|
1
|
|
98°C
|
10 sec
|
参照注意事项三，文库扩增
|
|
60°C
|
30 sec
|
|
72°C
|
30 sec
|
|
72°C
|
1 min
|
1
|
|
4°C
|
Hold
|
–
|
Step 7 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入32 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取30 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。
Step 6 文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。
HB230214
