DNase活性检测试剂盒（荧光标记法）使用一种新型DNA底物，其一端标记有荧光报告基团分子，另一端标记有淬灭基团。在不存在DNase时，淬灭基团的物理接近会将荧光报告基团中的荧光淬灭到极低水平。当有DNase时，DNA底物被水解，荧光报告基团和淬灭基团在溶液中的空间上发生分离，这导致荧光报告基团在被适当波长的光激发时发出明亮的荧光，该荧光可以通过多功能酶标仪（含荧光模块）和荧光定量PCR仪进行检测。
DNase活性检测试剂盒（荧光标记法）采用底物荧光标记法，可定量或定性的检测单个样品中的DNase，从而判断样本是否有DNase污染。
产品信息
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货号
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41322ES48 / 41322ES68
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规格
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48 T / 192 T
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检测范围
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1.25×10-6U/μL~1×10-5U/μL
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检测方法
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荧光标记法
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检测时长
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1小时
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灵敏度
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1.25×10-6U/μL
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板内差
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<10%
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板间差
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<15%
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储存条件
Part Ⅰ，-25~-15℃保存；Part Ⅱ，常温保存*。有效期1年**；
*Part Ⅰ，-25~-15℃运输；Part Ⅱ，常温运输。收到货后，请检查各组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。
**试剂盒未拆封有效期1年，拆封后有效期6个月，建议将A组分溶液按照每次使用量进行分装避免反复冻融影响质量。
使用说明
- 实验前准备
- 本试剂盒未提供但实验所需的实验材料：
a. 无 DNase 无 RNase 移液器与吸头
b. 无 DNase 无 RNase EP 管
c. 无 DNase 无 RNase 黑色不透明底 96 孔板
- 本试剂盒未提供但实验所需的实验设备和仪器：
a. 多功能酶标仪（含荧光模块，含ex/em=485/525nm波长，且具有荧光增益值调节功能)或者荧光定量PCR仪。
- 实验环境准备
为避免外源DNase污染，实验开始前，先使用试剂盒中的Surface DNase Remover（41322-G）对实验环境进行处理，可喷洒于实验台面、手套等表面，5分钟后用洁净纸巾擦拭干净即可进行后续的实验操作。
- 试剂配制
所有试剂在实验前，请先平衡至室温（18~25℃），充分振荡混匀后，瞬时离心（4000~7000rpm离心10秒）。
- DNase Substrate Stock solution：将A组分平衡至室温后，4000~7000rpm离心60s，小心打开盖子后加入40μL B组分制备成DNase Substrate Stock solution，然后根据每次实验用量将母液进行分装，-25~-15℃储存，避免反复冻融。
- DNase Substrate Work solution：实验开始前，取出DNase Substrate Stock solution恢复至室温后进行50倍稀释，现配现用，注意避光。举例：向10μL DNase Substrate Stock solution中加入490μL B组分，轻微震荡混匀后离心。
- 首次使用时的增益值调节
因实验室所用酶标仪不同，首次测试前需调节合适的增益值，以避免灵敏度下降或信号过饱和的风险。
- 加样：
实验前注意事项：1. 加样操作应尽量快，时间过长会影响实验准确性；2. 所有试剂使用前应充分混匀，加样时应将样品加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
使用无DNase无RNase黑色不透明底96孔板，选择2个孔，每孔加入10μL DNase Substrate Work solution和10μL C组分；随后向2个孔中的其中1个孔内加入80μL F组分（阴性对照，NC），另外1个孔内加入79μL F组分+1μL D组分（阳性对照1，PC1）。
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组分编号
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组分名称
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体积（总体积100 μL）
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NC
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PC1
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/
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DNase Substrate Work solution
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10 μL
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10 μL
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C
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10×Reaction buffer
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10 μL
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10 μL
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F
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DNase&RNase free water
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80 μL
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79 μL
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D
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DNase I（2U/μL）
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/
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1 μL
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表1：增益值调节体系配制
- 孵育：
在37℃条件下避光放置30min后测试。
- 仪器参数设置：
温度37℃，终点模式，检测前振板10~15s，激发波长λEx = 485 nm，发射波长λEm = 525 nm。
- 增益值调节：
如果酶标仪有自动增益选项，则选用自动增益。如果酶标仪没有自动增益选项，则根据增益值范围先设置中间值，然后根据反应后阳性对照1（PC1）的荧光值来调节合适的增益值：如超过仪器上限，则适当降低增益值，如远低于仪器上限，则适当调高增益值。
*不同荧光酶标仪的参数不一样，首次测试前需调节合适的增益值，若酶标仪不具备设置增益值的功能，可选用荧光定量PCR仪(含FAM通道)配套无DNase无RNase的qPCR八联管或qPCR 96孔板使用。荧光定量PCR仪参数设置为FAM通道，反应程序37℃，1min (读取荧光)，30个循环，反应体积100μL。使用原始荧光曲线数据进行计算，第1个循环作为RFU0，第30个循环作为RFU30。
- 实验方法
本品可对样品中具有活性的DNase进行定性检测或者定量检测，用户可根据实际情况和实验目的选择使用其中一种检测方法。本说明书中列举了2种检测方法的具体操作内容。
实验前注意事项：1. 加样操作应尽量快，时间过长会影响实验准确性；2. 所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
- 定性检测：
- 样品和反应体系制备：实验共设置3种样品进行检测，包括1个阴性对照（NC），1个阳性对照2（PC2）和待测样品（UnK）。先根据总样品数量计算需要制备的反应溶液体积（20μL/孔）：
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组分编号
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组分名称
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反应溶液体积
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1个孔
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10个孔
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N个孔
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/
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DNase Substrate Work solution
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10 μL
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110 μL
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10×（N+1）μL
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C
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10×Reaction buffer
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10 μL
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110 μL
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10×（N+1）μL
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表2：反应溶液体系配制（定性实验）
再根据样品数量把制备好的反应溶液分装到各孔中，20μL/孔。随后向各孔中加入对应样品：
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组分编号
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样品名称
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体积
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NC
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PC2
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UnK
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F
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DNase&RNase free water
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80 μL
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/
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/
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/
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DNase I（2×10-5U/μL）*
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/
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80 μL
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/
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/
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待测样品（UnK）**
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/
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/
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80 μL
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表3：样品添加（定性实验）
*DNase I（2×10-5U/μL）：用Dilution Buffer 2（E组分）将DNase I（2U/μL）稀释105倍，每步稀释倍数不要大于100倍，从而得到2×10-5U/μL DNase I：
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管号
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Dilution Buffer 2的体积（μL）
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加入的标准品体积（μL）
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终浓度（U/μL）
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A
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198μL
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2μL DNase I（2U/μL）
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2×10-2 U/μL
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B
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198μL
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2μL A
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2×10–4 U/μL
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C
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180μL
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20μL B
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2×10–5 U/μL
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表4：DNase I（2×10-5U/μL）配制
**待测样品（UnK）：需要根据实际待测样本的情况，考虑是否需要用DNase&RNase free water对样品进行适当稀释。建议进行加标实验，以评估是否存在因样本抑制导致的假阴性情况。具体加标样品中终DNase I浓度建议为2×10-5U/μL。选择合适稀释倍数时需要注意，如果UnK严重污染了DNase或含有干扰物质时，可能会出现RFU0（UnK）＞RFU0（PC2），且RFU30（UnK）＜2×RFU0（UnK），导致假阴性结果的情况，说明当前稀释倍数不适合进行样本检测，需要做进一步稀释或处理。
- 检测：
提前10min，预热酶标仪。立即读取0min时的荧光信号值RFU0。37℃避光放置30min后，再次读取30min时的荧光信号值RFU30，若采用动力学模式，则可读取0~30min所有荧光信号。
- 结果判读：
若NC的荧光值孵育前后变化不超过50%，PC2的RFU30 远大于 2RFU0，且UnK的RFU30≥2RFU0，则判定UnK被DNase 污染。
- 定量检测：
- 样品制备：
DNase I标准品制备：
稀释分2步进行：先使用Dilution buffer 2将标准品稀释成10×母液，再使用DNase&RNase free water将10×母液稀释成终浓度。具体稀释建议见下表。
稀释1：
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管号
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Dilution Buffer 2的体积（μL）
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加入的标准品体积（μL）
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终浓度（U/μL）
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a
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198μL
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2μL DNase I（2U/μL）
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2×10-2 U/μL
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b
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198μL
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2μL a
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2×10-4 U/μL
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c
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100μL
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100μL b
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1×10-4 U/μL
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|
d
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100μL
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100μL c
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5×10-5 U/μL
|
|
e
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100μL
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100μL d
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2.5×10-5 U/μL
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|
f
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100μL
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100μL e
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1.25×10-5 U/μL
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表5：DNase I标准品稀释1
稀释2：
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管号
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DNase&RNase free water的体积（μL）
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加入的标准品体积（μL）
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终浓度（U/μL）
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STD-A
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180μL
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20μL c
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1×10-5 U/μL
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STD-B
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180μL
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20μL d
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5×10-6 U/μL
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STD-C
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180μL
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20μL e
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2.5×10-6 U/μL
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STD-D
|
180μL
|
20μL f
|
1.25×10-6 U/μL
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STD-E
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200μL
|
0
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0 U/μL
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表6：DNase I标准品稀释2
- 反应体系制备：实验共设置3种样本进行检测，包括1个阴性对照（NC），DNase I标准品和待测样品（UnK）。先根据总样本数量计算需要制备的反应溶液体积（20μL/孔）：
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组分编号
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组分名称
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反应溶液体积
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1个孔
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10个孔
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N个孔
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/
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DNase Substrate Work solution
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10 μL
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110 μL
|
10×（N+1）μL
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|
C
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10×Reaction buffer
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10 μL
|
110 μL
|
10×（N+1）μL
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表7：反应溶液体系配制（定量实验）
再根据样本数量把制备好的反应溶液分装到各孔中，20μL/孔。随后向各孔中加入对应样品：
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组分编号
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样品名称
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体积
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|
|
NC
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DNase I标准品
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UnK
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F
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DNase&RNase free water
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80 μL
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/
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/
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/
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表6中制备的STD A~G
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/
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80 μL
|
/
|
|
/
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待测样品（UnK）**
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/
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/
|
80 μL
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表8：样品添加（定量实验）
**待测样品（UnK）：需要根据实际待测样本的情况，考虑是否需要用DNase&RNase free water对样本进行适当稀释。建议进行加标实验，以评估是否存在因样本抑制导致的假阴性情况。具体加标样品中终DNase I浓度建议为5×10-6 U/μL。选择合适稀释倍数时需要注意，如果UnK严重污染了DNase或含有干扰物质时，可能会出现RFU0（UnK）＞RFU0（PC2），且RFU30（UnK）＜2×RFU0（UnK），导致假阴性结果的情况，说明当前稀释倍数不适合进行样本检测，需要做进一步稀释或处理。
推荐的板布局：
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板布局
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1
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2
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3
|
4
|
5
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6~12
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A
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STD-A
|
STD-A
|
|
UnK-1
|
UnK-1
|
|
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B
|
STD-B
|
STD-B
|
|
UnK-2
|
UnK-2
|
|
|
C
|
STD-C
|
STD-C
|
|
UnK-3
|
UnK-3
|
|
|
D
|
STD-D
|
STD-D
|
|
UnK-4
|
UnK-4
|
|
|
E
|
STD-E
|
STD-E
|
|
UnK-5
|
UnK-5
|
|
|
F
|
|
|
|
UnK-6
|
UnK-6
|
|
|
G
|
|
|
|
UnK-7
|
UnK-7
|
|
|
H
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NC
|
NC
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UnK-8
|
UnK-8
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表9：推荐的板布局
- 检测：
提前10min，预热酶标仪。立即读取0min时的荧光信号值RFU0。37℃避光放置30min后，再次读取30min时的荧光信号值RFU30，若采用动力学模式，则可读取0~30min所有荧光信号。
- 结果判读：
计算∆RFU=RFU30-RFU0，以∆RFU(STD A~G)为纵坐标，标准品DNase I浓度为横坐标进行线性拟合，求出拟合方程y=ax+b，相关系数r≥0.99，将∆RFU(UnK)作为y带入方程，求出x，乘以样本稀释倍数后，即为样本中DNase的浓度值。
*因仪器信号波动，可能会出现∆RFU＜0的情况，此时按∆RFU=0计算。
产品性能
本试剂盒性能经过充分评估，具体可联系翌圣技术人员获取相应的性能验证报告。
注意事项
1）使用本试剂盒前请仔细阅读本说明书；
2）请在有效期内使用该产品，禁止不同批次的相关试剂进行混用；
3）所有试剂在使用之前，均需要恢复至室温；
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
5）本产品仅用作科研用途。
