产品描述

2× Hieff Canace^® PCR Master Mix是即用型2×预混合溶液，包含Hieff Canace^® High-Fidelity DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓冲体系。Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶，具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，其保真性是Taq DNA聚合酶的52倍，是普通Pfu DNA聚合酶的6倍。扩增速度可达15 sec/kb。适用于复杂模板的扩增，扩增产物为平末端。

2× Hieff Canace^® PCR Master Mix具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，反应体系只需加入引物和模板即可进行扩增，简化了实验操作步骤，减少了人为误差，提高了实验通量和结果的重复性。本产品中不含染料，PCR产物需加入Loading buffer 后进行电泳。另外，该产品还含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。
 

产品应用

基因克隆；复杂DNA模板扩增；高通量建库。
 

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存。有效期2年。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
2）本产品仅作科研用途！

推荐PCR反应体系（冰上配制）

【注】：
1）聚合酶终浓度：在1×预混液含有1 U/50 μL的聚合酶。
2）引物：PCR反应体系中引物终浓度的范围为0.2-1 μM，推荐0.5 μM。
3）Mg2+、dNTP终浓度：在1×预混液含有1.5 mM Mg2+和200 μM的dNTP。
4）高GC模板：在体系中加入终浓度为3%的DMSO可能有利于扩增。
5）不同模板的推荐使用量（50 μL反应体系）：

PCR扩增程序设置

【注】：
1）预变性温度和时间：推荐使用98℃。预变性推荐时间：质粒DNA等简单模板为30 sec；cDNA、基因组DNA等复杂模板为3 min；高GC含量模板为5-10 min。
2）退火温度和时间：推荐使用60℃，也可根据需要，设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20 sec，可以在10-30 sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
3）延伸温度和时间：推荐使用72℃。延伸时间推荐如下：质粒DNA等简单模板为15 sec/kb；cDNA、基因组DNA等复杂模板为30 sec/kb，根据实际情况可延长至40 sec/kb。
4）扩增产物：请将PCR扩增产物放置于-20℃保存，防止该酶降解扩增产物。扩增产物为平末端，产物直接用于克隆，请使用平末端连接载体。
 

应用实例

图1： Hieff Canace® 高保真PCR预混液扩增2.1 kb-6 kb目的片段。所有基因片段均可实现高特异性、高产量扩增。模板：拟南芥基因组DNA，50 ng/50 μL；退火温度：60℃；延伸时间：30 sec/kb。M：1 kb ladder； 1：2.1 kb；2：3.1 kb；3：4.2 kb；4：5 kb；5：6 kb。

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2.保存不当突变。

原因：反复冻融或长时间紫外照射可能导致模板发生断裂或突变，突变位置不定。

判断方法：将模板与 T 载体连接产生的克隆送测序，测序结果与模板序列对比，发生突变且位置不定，可认为是因保存不当导致模板发生了突变。

优化方法：尽量减少模板的反复冻融或紫外照射。原因 2：酶保真性差。

DNA 聚合酶保真性差，导致突变的概率大，在长片段扩增中更常见。

判断方法：将模板与 T 载体连接产生的克隆送测序，模板不突变。以模板扩增得到的产物进行克隆测序后发生突变，且突变位置不恒定，可认为是 PCR 过程中发生的突变， 常是由于酶保真性差导致。

优化方法：更换成保真性更高的产品。注：保真性高低代表突变概率的高低，保真性再高的产品均不能完全避免突变。

[1] Zhang Q, Xie Z, Zhang R, et al. Blue Light Regulates Secondary Cell Wall Thickening via MYC2/MYC4 Activation of the NST1-Directed Transcriptional Network in Arabidopsis. Plant Cell. 2018;30(10):2512-2528. doi:10.1105/tpc.18.00315(IF:8.228)
[2] Chen JJ, You XJ, Li L, et al. Single-Base Resolution Detection of Adenosine-to-Inosine RNA Editing by Endonuclease-Mediated Sequencing. Anal Chem. 2022;94(24):8740-8747. doi:10.1021/acs.analchem.2c01226(IF:6.986)

Q：Canace 具有保真性的原理是？错配率是多少？能保证不突变吗？

A:  a）原理是具有 3’-5’的核酸外切酶活性，即有校正功能。

b）Taq 酶错配率：2*10–4，0.0002，大约5kb 有一个碱基发生突变。Canace 约0.00039%，是 taq 酶的 52 倍。

c）高保真酶是突变概率低，但不是绝对的不突变。

Q：Canace 扩增后是平末端产物，如何加 A 尾？

A：仅供参考：先对平末端PCR 产物纯化后，浓度要求至少 20ng/ ul（跑胶图像条带清晰，明亮即可），取 14.5 ul PCR 产物，加入 2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在 72℃反应 10~20min, 后直接回收纯化加A 尾的DNA 片段。

Q：Canace 能否用于 XX 长度的片段？

A：验证范围内长度理论上是可以的（验证范围：简单模板 20kb，复杂模板 10kb）。但具体能否扩出，还与模板和引物等有关。

Q：产物突变？

A：原因 1：模板突变。 1.原始模板序列有突变。

原因：原始模板序列有突变会使扩增产物的突变位点恒定，表现在多个克隆测序发生突变，且突变位置恒定。

判断方法：将模板与 T 载体连接产生的克隆送测序，测序结果与模板序列对比，发生突变且位置恒定，可认为是模板序列发生突变。

优化方法：更换序列正确的模板。