KOD-Plus-Neo是基于一种ji端嗜热的海洋古生菌Thermococcus kodakarensis的DNA聚合酶。这种聚合酶由于其高效的3’–5’核酸外切酶活性(校对活性)。该产品含有一种du特的“延伸增强剂“,可抑制传统PCR产生的“平台效应“。因此,与先前版本的KOD-Plus(KOD-201)相比,该试剂表现出更高的扩增效率和延伸能力。此外,这种酶对于PCR延伸步骤仅需要30秒/kb。这有利于长片段PCR。这种酶含有两种抑制聚合酶和3’–5’核酸外切酶活性的抗KOD DNA聚合酶抗体和,从而支持热启动PCR。
产品特点
Ø 比普通Taq DNA聚合酶高80倍的PCR保真度。
Ø 与传统PCR相比,“延伸增强剂“能够实现更高的扩增效率和延伸能力。
Ø PCR延伸步骤只需要30秒/kb。
Ø 两步循环条件可用于使用≥20 mer引物的扩增(退火温度,Tm>63°C)。
产品组分
KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)*
|
200 μL×1
|
10 x PCR Buffer for KOD -Plus-Neo
|
1 mL×1
|
25 mM MgSO4
|
1 mL×1
|
2 mM dNTPs
|
1 mL×1
|
引物设计
Ø 引物应为22-35个碱基,Tm>63℃
Ø 引物的最佳GC含量为45-60%。5’端和3’端的理想GC含量分别为60-70%和40-50%。
Ø 长片段扩增的引物应为25-35个碱基,Tm>65°C。
Ø 不能使用含有肌苷的引物
Ø 建议使用最近邻法计算引物的Tm。本手册中的Tm值是使用以下参数使用该方法计算的。Na+浓度:50 mM 寡核苷酸浓度:0.5 µM
PCR产物的克隆
Ø KOD-Plus-Neo由于其3’–5’核酸外切酶活性。因此,PCR产物为平端产物,可以根据平端克隆方法进行克隆。
Ø KOD-Plus-Neo的PCR产物应在限制性内切酶处理之前进行纯化。KOD DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在PCR反应结束时仍然存在。
Ø 克隆KOD DNA聚合酶产生的平端PCR产物推荐专用TA克隆试剂盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)”
实验步骤
1. 标准反应体系配置
反应物准备前,除酶溶液外,所有成分均应wan全解冻。
组分
|
体积
|
终浓度
|
10x Buffer for KOD -Plus- Neo
|
5 μL
|
1x
|
2 mM dNTPs
|
5 μL
|
0.2 mM each
|
25 mM MgSO4
|
3 μL
|
1.5 mM
|
10 pmol/μL Primer #1
|
0.75–1.5 μL
|
0.15–0.3 µM
|
10 pmol/μL Primer #2
|
0.75–1.5 μL
|
0.15–0.3 µM
|
Template DNA
|
X μL
|
Genomic DNA ≤ 200 ng/50 μL
Plasmid DNA ≤ 50 ng/50 μL
cDNA ≤ 200 ng(RNA equiv.)/50 μL
|
PCR grade water
|
Y μL
|
|
KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)
|
1 μL
|
1.0 U/50 μL
|
总体积
|
50 μL
|
|
**不要使用其它试剂盒或其它公司的dNTP
注意:
最佳引物浓度为0.3 µM。在长片段(≥10kb)的情况下,降低引物浓度(0.15µM)可能会产生更有效的扩增。
二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加有利于扩增富含GC的靶标。在DMSO存在的情况下,PCR保真度不会降低(参见步骤2,循环条件)。
cDNA或基因组DNA中的污染RNA会通过螯合Mg2+来抑制PCR反应。应使用<200 ng RNA的模板DNA进行PCR。
模板DNA的质量应通过电泳检查。模板DNA的长度和纯度会影响扩增结果。
含有尿嘧啶的模板不能用于扩增。
对于PCR反应,建议使用薄壁管。建议总反应体积为50 μL。
2. 循环条件
推荐≥20 mer的引物,Tm>63°C的两步循环条件用于有效扩增。
两步循环:
如果引物的Tm值超过63°C,建议采用两步循环。
注意:
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段(>10kb)的扩增,更长的延伸时间(高达1 min/kb)或更高的Mg2+浓度(高达2 mM终浓度)可以提高产率。
二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。
<25 mer or Tm <68℃: 加2%
≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%
如果扩增失败,可能需要3步循环
三步循环:
当引物的Tm小于63℃时,应使用三步循环。
注意:
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段(>10kb)的扩增,更长的延伸时间(高达1 min/kb)或更高的Mg2+浓度(高达2 mM终浓度)可以提高产率。
二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加可能有利于扩增富含GC的片段。
降落PCR:
如果在2步和3步循环条件下观察到非特异性扩增(在PCR产物电泳后观察到额外的条带),降落PCR则可以提高特异性。
注意:
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段(>10kb)的扩增,更长的延伸时间(高达1 min/kb)或更高的Mg2+浓度(高达2 mM终浓度)可以提高产率。
二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。
<25 mer or Tm <68℃: 加2%
≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%
应用实例
性能数据:
1. PCR保真度
用TArget克隆技术对从人基因组DNA中扩增的人β-珠蛋白基因产物进行序列分析,测定突变频率。KOD-Plus-Neo表现出ji好的保真度,突变频率与以前版本的酶(KOD-Plus-)相同。
2. 延伸能力
根据每种酶的推荐条件,通过几种PCR酶从人类基因组DNA中扩增出各种大小的片段。KOD-Plus-Neo成功扩增了17.5 kb的片段。
3. 低拷贝模板扩增
使用0.5 ng cDNA模板扩增四个基因。模板由HeLa细胞的总RNA合成。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有基因。
4. 延伸速度
不同的扩增时间从人类基因组DNA(50ng)中扩增β–珠蛋白基因(3.6 kb)。KOD-Plus-Neo可以用30秒/kb的延长时间扩增3.6 kb的靶标。
应用数据:
1. 各种蛋白激酶片段的扩增
利用HeLa细胞总RNA合成的cDNA扩增各种蛋白激酶开放阅读框。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有片段。
2. 长片段扩增
使用不同浓度的引物从人类基因组DNA中扩增长片段。过多的引物会抑制扩增。因此,应使用约0.15 µM的较低引物浓度扩增长片段(>10 kb)。
常见问题及解决办法
问题
|
可能的原因
|
解决办法
|
无产物或低产量
|
循环条件不合适
|
使用三步循环,将退火温度逐渐降低至最大Tm-5–10°C
|
将延伸时间延长至1分钟/kb
|
将循环次数增加2-5个循环
|
Mg2+浓度低
|
将Mg2+浓度增加至2 mM
|
目标序列GC含量高
|
加入2–5%的DMSO
|
引物的质量和/或浓度问题
|
将引物浓度逐步降低至0.15 µM
|
使用新的引物
|
重新设计引物
|
模板DNA的质量和/或浓度问题
|
检查模板DNA的质量
|
增加模板DNA的浓度
|
酶浓度低
|
将酶浓度提高至1.5–2.0 U/50 μL
|
弥散条带或杂带
|
循环条件不合适
|
将循环次数减少2-5个循环
|
从3步循环更改为2步循环
|
从2步循环更改为降落PCR
|
引物的质量问题
|
使用新的引物
|
重新设计引物
|
模板DNA太多
|
减少模板DNA的浓度
|
Mg2+浓度太高
|
将MgSO4逐步降低至1.0 mM
|
酶浓度太高
|
将酶浓度降至0.5–0.8 U/50 μL
|
TA克隆效率差
|
PCR产物具有平末端
|
使用专用TA克隆试剂盒TArget clone™-Plus-(Code No. TAK-201)
|
参考文献
1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).
2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).
3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).
4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).
产品订购
货号
|
产品名称
|
规格
|
品牌
|
KOD-401
|
KOD -Plus- Neo
|
200 reactions
|
TOYOBO
|
相关产品
货号
|
产品名称
|
规格
|
品牌
|
TAK-201
|
TArget Clone™ -Plus-
|
10 reactions
|
TOYOBO
|
TAK-301
|
10x A-attachment mix
|
25 reactions
|
TOYOBO
|
LGK-201
|
Ligation high Ver.2
|
750 μL (100 reactions)
|
TOYOBO
|