KOD-Plus-Neo是基于一种ji端嗜热的海洋古生菌Thermococcus kodakarensis的DNA聚合酶。这种聚合酶由于其高效的3’–5’核酸外切酶活性（校对活性）。该产品含有一种du特的“延伸增强剂“，可抑制传统PCR产生的“平台效应“。因此，与先前版本的KOD-Plus（KOD-201）相比，该试剂表现出更高的扩增效率和延伸能力。此外，这种酶对于PCR延伸步骤仅需要30秒/kb。这有利于长片段PCR。这种酶含有两种抑制聚合酶和3’–5’核酸外切酶活性的抗KOD DNA聚合酶抗体和，从而支持热启动PCR。

产品特点

Ø 比普通Taq DNA聚合酶高80倍的PCR保真度。

Ø 与传统PCR相比，“延伸增强剂“能够实现更高的扩增效率和延伸能力。

Ø PCR延伸步骤只需要30秒/kb。

Ø 两步循环条件可用于使用≥20 mer引物的扩增（退火温度，Tm>63°C）。

 

产品组分

 

引物设计

Ø 引物应为22-35个碱基，Tm>63℃

Ø 引物的最佳GC含量为45-60%。5’端和3’端的理想GC含量分别为60-70%和40-50%。

Ø 长片段扩增的引物应为25-35个碱基，Tm>65°C。

Ø 不能使用含有肌苷的引物

Ø 建议使用最近邻法计算引物的Tm。本手册中的Tm值是使用以下参数使用该方法计算的。Na⁺浓度：50 mM 寡核苷酸浓度：0.5 µM

 

PCR产物的克隆

Ø KOD-Plus-Neo由于其3’–5’核酸外切酶活性。因此，PCR产物为平端产物，可以根据平端克隆方法进行克隆。

Ø KOD-Plus-Neo的PCR产物应在限制性内切酶处理之前进行纯化。KOD DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在PCR反应结束时仍然存在。

Ø 克隆KOD DNA聚合酶产生的平端PCR产物推荐专用TA克隆试剂盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)”

实验步骤

1. 标准反应体系配置

反应物准备前，除酶溶液外，所有成分均应wan全解冻。

**不要使用其它试剂盒或其它公司的dNTP

注意：

最佳引物浓度为0.3 µM。在长片段（≥10kb）的情况下，降低引物浓度（0.15µM）可能会产生更有效的扩增。

二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加有利于扩增富含GC的靶标。在DMSO存在的情况下，PCR保真度不会降低（参见步骤2，循环条件）。

cDNA或基因组DNA中的污染RNA会通过螯合Mg2+来抑制PCR反应。应使用<200 ng RNA的模板DNA进行PCR。

模板DNA的质量应通过电泳检查。模板DNA的长度和纯度会影响扩增结果。

含有尿嘧啶的模板不能用于扩增。

对于PCR反应，建议使用薄壁管。建议总反应体积为50 μL。

2. 循环条件

推荐≥20 mer的引物，Tm>63°C的两步循环条件用于有效扩增。

 

两步循环：

如果引物的Tm值超过63°C，建议采用两步循环。

 

注意：

对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的Mg²⁺浓度（高达2 mM终浓度）可以提高产率。

二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。

<25 mer or Tm <68℃: 加2%

≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%

如果扩增失败，可能需要3步循环

三步循环：

当引物的Tm小于63℃时，应使用三步循环。

 

注意：

对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的Mg²⁺浓度（高达2 mM终浓度）可以提高产率。

二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含GC的片段。

降落PCR：

如果在2步和3步循环条件下观察到非特异性扩增（在PCR产物电泳后观察到额外的条带），降落PCR则可以提高特异性。

 

注意：

对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的Mg²⁺浓度（高达2 mM终浓度）可以提高产率。

二甲基亚砜DMSO（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。

<25 mer or Tm <68℃: 加2%

≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%

 

应用实例

性能数据：

1. PCR保真度

用TArget克隆技术对从人基因组DNA中扩增的人β-珠蛋白基因产物进行序列分析，测定突变频率。KOD-Plus-Neo表现出ji好的保真度，突变频率与以前版本的酶（KOD-Plus-）相同。

 

2. 延伸能力

根据每种酶的推荐条件，通过几种PCR酶从人类基因组DNA中扩增出各种大小的片段。KOD-Plus-Neo成功扩增了17.5 kb的片段。

3. 低拷贝模板扩增

使用0.5 ng cDNA模板扩增四个基因。模板由HeLa细胞的总RNA合成。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有基因。

4. 延伸速度

不同的扩增时间从人类基因组DNA（50ng）中扩增β–珠蛋白基因（3.6 kb）。KOD-Plus-Neo可以用30秒/kb的延长时间扩增3.6 kb的靶标。

 

应用数据：

1. 各种蛋白激酶片段的扩增

利用HeLa细胞总RNA合成的cDNA扩增各种蛋白激酶开放阅读框。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有片段。

 

2. 长片段扩增

使用不同浓度的引物从人类基因组DNA中扩增长片段。过多的引物会抑制扩增。因此，应使用约0.15 µM的较低引物浓度扩增长片段（>10 kb）。

 

常见问题及解决办法

 

参考文献

1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).

2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).

3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).

4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).

 

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