Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料PE（Phycoerythrin）标记的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

另外，本试剂盒中提供的7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料，同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将Annexin V-PE与7-AAD联合使用时，7-AAD则被排除在活细胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V-PE和7-AAD结合染色呈现双阳性（Annexin V+/7-AAD+）。

产品组分

*来源于大肠杆菌（E.coli），分子量为35.8 KDa，纯度＞98%（SDS-PAGE & HPLC）

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。本试剂盒中所有组分均在4 ℃保存，勿冰冻。Annexin V-PE、7-AAD需避光保存。一年有效。

注意事项

1）试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

2）由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。

3）对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，7-AAD摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-PE的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

4）如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并低速离心（200×g）洗去血小板，然后用Annexin V结合缓冲液清洗细胞，以避免残留的EDTA会螯合Ca²⁺。

5）7-AAD为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。

6）Annexin V-PE和7-AAD是光敏物质，在操作时请注意避光。

7）本产品仅作科研用途！

使用说明

1. 样品染色

1） 悬浮细胞：300 g，4 ℃离心5 min收集细胞。

贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4 ℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

2）配制1×Binding Buffer：用去离子水4倍稀释4×Binding Buffer（4 mL 结合缓冲液+12 mL 去离子水）。

3）用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300 g，4 ℃离心5 min。

4）加入250 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1×10⁶细胞/mL。

5）取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/PE和10 μL 7-AAD，轻轻混匀。

6）避光、室温反应15 min。

7）加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，样品在1小时内检测。

【注】：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

2. 观察检测

A、流式细胞仪分析

1）用流式细胞仪检测，Annexin V-PE的激发波长Ex=488nm；发射波长Em=578 nm，发出橙红色荧光，建议使用FL2通道检测；7-AAD的激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm，发出红色荧光，建议使用FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），PE为横坐标，7-AAD为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅呈很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅呈较强的橙红色荧光，晚期凋亡细胞呈橙红和红色荧光双重染色。

2）荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

B、荧光显微镜观察

1）滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；

2）对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；

a 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；

b 用PBS洗涤细胞两次；

c 在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-PE，5 μL 7-AAD染液混匀；

d 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；

e 室温避光孵育5 min。

3）将盖玻片倒置于载玻片上，在荧光显微镜下用双色滤光片观察。滤光片（罗丹明）观察Annexin V-PE 荧光信号呈橙红色；用激发波长546 nm，发射波长647 nm，观察7-AAD荧光信号呈红色。

HB210802

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Q:这两个试剂用什么通道检测？仪器是贝克曼的。

A: Annexin V-PE 的激发波长Ex=488nm；发射波长Em=578 nm，发出橙红色荧光，建议使用 FL2 通道检测；7-AAD 的激发波长 Ex=546 nm；发射波长 Em=647 nm，发出红色荧光， 建议使用 FL3 通道检测。

Q: Annexin V-PE 染色失败或者阳性率偏低。

A:首先要确定实验中使用的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。Annexin V-PE 染色失败，最常见的实验操作原因是贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟 PS 的结合需要 Ca2+，Binding Buffer 中含有 2.5 mM 的 Ca2+，含 EDTA 的胰酶消化会影响染色，建议使用无EDTA 的胰酶。若使用含EDTA 的胰酶，必须通过洗涤步骤彻底去除EDTA。用 PBS 洗涤细胞沉淀后，应尽量去除残余液体。残留PBS 中的磷酸根，会形成磷酸钙沉淀。Binding Buffer 的瓶盖要紧闭，防止空气中的 CO2 进入后形成碳酸钙沉淀，减少游离Ca2+，导致实验失败。接触其他缓冲液如吸取PBS 后不更换枪头也会导致游离的 Ca2+减少。一些细胞其细胞膜上 PS 的密度较低，染色效果很差，此时建议更换细胞株或者采用 TUNEL 试剂盒检测凋亡。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞也要收集，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。

Q: 假阳性

A: 实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后Annexin V-PE/7-AAD 双阳性比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力低。建议用台盼蓝染色计算细胞活力，阴性对照台盼蓝拒染的细胞应大于 95%。若细胞活力低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少应传代 2– 3 次以后才能进行实验。另一可能是细胞操作不当引起，操作过程中吹打细胞过于剧烈，贴壁细胞消化过程中消化时间过长，均可能导致细胞膜破坏，出现假阳性。此外，一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于 48 h 以上；诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。