Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用耐热Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并搭配使用探针和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase，配合优化的缓冲体系能够特异灵敏的对RNA模板进行精确定量。

本试剂盒以预混的Mix形式提供，2×Hifair® Ⅲ P buffer包含优化的缓冲体系和dNTPs等，优化了有效抑制非特异性 PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适用于荧光标记探针的高特异性检测系统。此外，Hifair® UH Ⅲ Enzymes包含比例优化的Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase inhibitor及UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase等。

产品组分

【注】P buffer 为Probe buffer 的简写，UH 为UNICON-Hifair 的简写。

适用机型

High Rox 适用机型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™

Low Rox 适用机型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

不需要 Rox 校正的仪器型号：

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96

Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。本品避免反复冻融。建议分装保存。

注意事项

1. 实验过程中请使用 RNase free 耗材。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

反应体系（以 20 μL为例）

【注】:

a 所有试剂使用前应充分混匀。

b 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】。

c 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

d 探针浓度：探针终浓度可在50 nM-250 nM之间调整。

e 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

f 模板稀释：一步法RT-qPCR灵敏度极高，推荐将模板稀释后(如稀释至2-5 μL/样本)加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。

g 反应体系：建议以大体系进行实验，如20 μL或50 μL。

标准扩增程序

【注】:

a 对于含复杂二级结构或高GC含量的RNA模板，可将逆转录温度提高到55℃，有助于提升扩增效率和灵敏度。

b 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整，时间为5min时可满足大多数基因的鉴定。

c 不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。

HB220304

Q：标准曲线扩增效率小于 90%或者大于 110%，线性关系不好，这样的问题如何解决？

A：加样误差。加大模板稀释倍数，提高加样体积，使不同稀释度的加样体积更准确；

标准品降解。重新制备标准品；

模板浓度太高。存在反应抑制，增加模板稀释倍数； 引物扩增特异性不好。重新设计引物。

Q：反应结束无扩增曲线出现

A：反应循环数不够，可适当增加循环次数。一般设置为 40，需注意过多的循环会增加背景信号，降低数据可信度；

确认程序中是否设置了信号采集步骤。三步法扩增程序应该将信号采集设置在 72℃延伸阶段， 两步法一般在退火延伸阶段收集；

确认引物是否降解。长时间未使用的引物应先通过PAGE 电泳检测完整性； 模板浓度太低。减少稀释度重复实验；

模板降解。重新制备模板。

Q：实验重复性差如何解决？

A：加样体积不准。定期校正移液器，将模板高倍稀释，以大体积加入反应体系中； 定量PCR 仪器不同位置温度控制不一致，定期校准仪器；

模板浓度太低。模板浓度越低，重复性越差； 做 4-6 个复孔，删除其中重复性不好的孔。

Q：模板的稀释液如何选择？

A：Nuclease-Free water、DEPC 水或实验室自备的 ddH2O 都可以。不推荐使用 TE 作为稀释液，TE 里有EDTA 会抑制酶的活性。

[1] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046(IF:36.216)
[2] Liu CX, Guo SK, Nan F, Xu YF, Yang L, Chen LL. RNA circles with minimized immunogenicity as potent PKR inhibitors. Mol Cell. 2022;82(2):420-434.e6. doi:10.1016/j.molcel.2021.11.019(IF:17.970)
[3] Chen S, Luo X, Wu W, et al. The long non-coding RNA MACC1-AS1 promotes nasopharyngeal carcinoma cell stemness via suppressing miR-145-mediated inhibition on SMAD2/MACC1-AS1 axis. Biomed Pharmacother. 2020;125:109986. doi:10.1016/j.biopha.2020.109986(IF:4.545)
[4] Wang J, Ren D, Sun Y, et al. Inhibition of PLK4 might enhance the anti-tumour effect of bortezomib on glioblastoma via PTEN/PI3K/AKT/mTOR signalling pathway. J Cell Mol Med. 2020;24(7):3931-3947. doi:10.1111/jcmm.14996(IF:4.486)
[5] Bi X, Jiang Z, Luan Z, Qiu D. Crocin exerts anti-proliferative and apoptotic effects on cutaneous squamous cell carcinoma via miR-320a/ATG2B. Bioengineered. 2021;12(1):4569-4580. doi:10.1080/21655979.2021.1955175(IF:3.269)
[6] Liu D, Wan L, Gong H, Chen S, Kong Y, Xiao B. Sevoflurane promotes the apoptosis of laryngeal squamous cell carcinoma in-vitro and inhibits its malignant progression via miR-26a/FOXO1 axis. Bioengineered. 2021;12(1):6364-6376. doi:10.1080/21655979.2021.1962684(IF:3.269)
[7] Shi M, Chen X, Li H, Zheng L. δ-tocotrienol suppresses the migration and angiogenesis of trophoblasts in preeclampsia and promotes their apoptosis via miR-429/ ZEB1 axis. Bioengineered. 2021;12(1):1861-1873. doi:10.1080/21655979.2021.1923238(IF:3.269)
[8] Tan Q, Lin S, Zeng Y, et al. Ginsenoside Rg3 attenuates the osimertinib resistance by reducing the stemness of non-small cell lung cancer cells. Environ Toxicol. 2020;35(6):643-651. doi:10.1002/tox.22899(IF:3.118)
[9] Liu X, Huang J, Xie Y, Zhou Y, Wang R, Lou J. Napabucasin Attenuates Resistance of Breast Cancer Cells to Tamoxifen by Reducing Stem Cell-Like Properties. Med Sci Monit. 2019;25:8905-8912. Published 2019 Nov 24. doi:10.12659/MSM.918384(IF:1.980)
[10] Guo W, Wei B, Cheng T, Xu X, Ruan F, Xiang M. The Na+/K+ ATPase Inhibitor Ouabain Attenuates Stemness and Chemoresistance of Osteosarcoma Cells. Med Sci Monit. 2019;25:9426-9434. Published 2019 Dec 11. doi:10.12659/MSM.919266(IF:1.980)
[11] Wu X, Wang Y, Zhong W, Cheng H, Tian Z. The Long Non-Coding RNA MALAT1 Enhances Ovarian Cancer Cell Stemness by Inhibiting YAP Translocation from Nucleus to Cytoplasm. Med Sci Monit. 2020;26:e922012. Published 2020 May 20. doi:10.12659/MSM.922012(IF:1.918)
[12] Wu X, Wang Y, Zhong W, Cheng H, Tian Z. RNA Binding Protein RNPC1 Suppresses the Stemness of Human Endometrial Cancer Cells via Stabilizing MST1/2 mRNA. Med Sci Monit. 2020;26:e921389. Published 2020 Feb 23. doi:10.12659/MSM.921389(IF:1.918)

Hifair® Advanced One Step RT-qPCR SYBR Green Kit是一款基于SYBR Green I染料进行荧光定量的试剂盒。使用基因特异性引物，反转录和qPCR反应在一管内完成，无需反复的开盖和移液操作，大大提高了检测效率，并降低了污染的风险。对于RNA样本，试剂盒采用耐热Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成cDNA，同时采用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase进行定量扩增。在优化的缓冲体系下，该试剂盒的检测灵敏度针对高表达的靶标, 可以检至0.1 pg，中等表达的靶标，可以检至1 pg。该试剂盒同时也适用于DNA样本的扩增定量。该试剂盒可实现不同动植物样本、细胞、微生物核酸的高灵敏检测和定量。

组分信息

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期1年。

使用说明

1. 推荐反应体系

表1反应体系*****

** 通常引物终浓度为0.2 μM，也可根据情况在0.1-1 μM之间进行调整。

*** 该试剂灵敏度极高，Total RNA在1 pg – 1 μg，人源样本测试显示最佳投入量为1 pg – 100 ng，控制Ct值整体在15-30之间为宜。

**** 推荐使用20 μL或 50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

***** 请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

2. 反应程序

表2 标准扩增程序

* 反转录温度可根据实验需求在50-55℃之间进行选择。对于DNA样本，反转录过程可省去。

** 特殊情况下退火/延伸温度可根据引物Tm值进行调整，建议使用60℃。

3. 适用机型

不需要Rox校正的仪器型号：

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR;

Low Rox适用机型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;

Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;

High Rox适用机型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus.

4. 引物设计技巧

1）引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增到假阳性的风险。

2）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

3）引物长度一般在18~27 bp，不应过长否则导致其延伸温度过高，不适于Taq DNA 聚合酶反应。

4）引物GC含量在40%~60%，GC含量过高或过低都不利于反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。可按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通过软件计算引物Tm值。

5）PCR产物的长度通常控制在80-300 bp,为了保证扩增效率，在设计引物时要考虑PCR产物的长度。

6）引物3′端末端尽量避免为A，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

7）碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

8）引物自身及引物之间避免存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其DG值不要过高（应小于4.5 kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

5. 异常结果分析

1. 无Ct值出现

1. 采集荧光信号的步骤有误：在退火/延伸结束采集信号；
2. 引物降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
3. 模板量不足：对未知浓度的样品应从原液开始测试；
4. 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值偏大 (Ct >35)

1. 扩增效率低：反应条件不够优化，引物设计存在问题，可试用三步法进行反应，也可适当降低退火温度等；
2. PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。

3)  标准曲线线性关系不佳

a.  加样存在误差：使得标准品不呈梯度；RNA模板推荐使用1×TE缓冲液（Cat #60143ES）进行梯度稀释，DNA模板推荐使用ddH₂O稀释;

b.  标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；

c.  引物设计不佳：重新设计引物；

d.  模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

4)  NTC有扩增（Ct<32）

a.  引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；

b.  引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

c.  气溶胶污染：扩增产物泄露很容易在实验室中引发气溶胶污染，一旦污染，定量检测结果就会不准确。推荐使用DNA/RNA Remover 核酸气溶胶污染清除剂（Cat #19702ES）。

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 加样和配液步骤都尽量在冰上操作。

4. 每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。