EZ Trans细胞转染液-说明书

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EZ Trans细胞转染液

C4058L1080

1mL

4

200

EZ Trans细胞转染液

C4058L1082

50mL

4

1800

EZ Trans细胞转染液

C4058L1084

500mL

4

3500

产品描述:

细胞转染液(核心成分为线性聚乙烯亚胺,也称作LPEI),是新一代的转染试剂,带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团 形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用,并通过胞吞作用进入细胞。除了具有阳离子脂质体(如:Lipo2000,3000)的转染效率高,操作简单,适用范围广,重复性好等特点外,还具有在体内,转染效率高,细胞毒性低等特点。

EZ Trans是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”体。其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。

使用方法:

瞬时转染方法

1. 接种细胞:转染前一天,用胶原酶消化细胞并计数(不建议用胰酶)。调整细胞浓度,将细胞铺入细胞培养的器皿,每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物: DNA、EZ Trans 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据下表所示,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释EZ Trans 试剂。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管,一边将稀释的EZ Trans转染试剂滴加至试管中(注意:请勿颠倒添加顺序)。充分混匀后,室温静置 10~25 min 以形成DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时,请用圆底聚丙烯管,例如 Falcon 5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞:直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时,去除生长培养基,替换成无血清培养基,然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后,添加1/2体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果:在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后zui快 7h 即可检测到转入基因的表达。请自行确定检测时间。?

稳定转染方法

1. 接种细胞:转染前一天,用胰酶消化细胞并计数。调整细胞浓度,将细胞铺入细胞培养的器皿,总体积如表 1 所示,每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物: DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据表 1 所示,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管,一边将稀释的EZ Trans转染试剂滴加至试管中(注意:请勿颠倒添加顺序)。充分混匀后,室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时,请用圆底聚丙烯管,例如 Falcon 5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞:直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时,去除生长培养基,替换成无血清培养基,然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后,添加½体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果:在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后zui快 7h 即可检测到转入基因的表达。

5.转染 24 h 后,将细胞传代至新鲜的生长培养基中(将细胞稀释 10 倍以上),在 CO2培养箱中 37℃孵育隔天。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约 1~2 周可筛选到耐药性克隆,在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。

运输与保存方法:

常温运输,4℃保存,保质期12个月。

使用注意事项:

质粒质量:请务必使用高质量转染级无内毒素质粒。通过 260 nm 光吸收测定 DNA 浓度,260 nm / 280 nm 比值确定 DNA 纯度(比值应该在 1.8~2.0 的范围之内)。如有可能,请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。

细胞条件:使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保培养基没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞,请在转染前至少传代两次。建议使用GIBCO或者李记生物的胎牛血清培养细胞。?

特别提醒:

1. 对于某些类型的细胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 细胞,在转染前两天铺板可显著提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板,可适当降低铺板密度,以确保转染时细胞的汇合度仍为 70~80%。

2. 对于接触抑制敏感的细胞,可适当降低铺板密度。

3. 即使在有蛋白(如 10%的血清)存在的情况下,DNA-PEI复合物仍能转染细胞,但是 DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。

4. 对大多数细胞来而言,每 1 μg DNA 使用 3.0 μLEndoFectinTM 试剂都能获得较高转染效率。使用者也可尝试每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 体积线性PEI转染试剂进行优化。

附:几种细胞转染方法比较

几种细胞转染方法(试剂)特点比较表

转染方法

原理

主要应用

特点

阳离子聚合物
EZ Trans

带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团 形成带正电的 复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用,并通过胞吞作用进入细胞。

稳定转染

瞬时转染

所有细胞

除了具有阳离子脂质体的转染效率高,操作简单,适用范围广,重复性好等特点外,还具有在体内,转染效率高,细胞毒性低等特点,是新一代的转染试剂。

阳离子脂质体法

带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电 核结合;另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高,中和脂质体表面电核,而降低了与细胞的结合能力)

稳定转染

瞬时转染

所有细胞

使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转 染各种类型的细胞,没有免疫原性。虽在体外基因转染 中有很高的效率,但在体 内,能被血清清除,并在肺组织内累积,诱发强烈的抗炎反应,导致高水平的毒性,这在很大程度上限制了 其应用

DEAE-葡聚糖法

带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞

瞬时转染

相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副 作用,转染时需除血清且一 般只用于BSC-1,CV-1,COS 细胞系

磷酸钙法

磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞

稳定转染

染瞬转染

不适用于原代细胞(所需的DNA浓度较高),操作简 便但重复性差,有些细胞不 适用  细胞建议用CSCL梯度离心,转染是拷贝数较多

逆转录病毒(RNA)

通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受 体相互作用而 进入宿主细胞,之后反转入酶 启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中

稳定转染

特定宿主细胞

可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携 带基因不能太大(<8kb), 细胞需处分裂期,需考虑安 全因素

腺病毒

(双链 DNA)

先和细胞表面 的受体结合,继 而在αv整合 素介导下被细 胞内吞

瞬时转染

特定宿主细胞

可用于难转染的细胞,需考虑安全因素

Biolistic颗粒传递法

(基因枪粒子轰击法)

将DNA用显微重金属颗粒沉 淀,再将包被好 的颗粒用弹道 装置投射入细 胞,DNA在胞内逐步释放,表达

瞬时性转染

稳定转染

可用于:人的表皮细胞, 纤维原细胞,淋巴细胞系以 及原代细胞

显微注射法

用显微操作将 DNA直接注入靶 细胞核

稳定转染

瞬时转染

转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的 胚胎细胞

电穿孔法

高脉冲电压破 坏细胞膜电位,DNA通过膜上形 成的小孔导入

稳定转染

瞬时转染

所有细胞

适用性广,除了质粒外,还可转染大的基因组 (>65kb)但细胞致死率高, DNA和细胞用量大,  需根 据不同细胞类型优化电穿 孔实验条件,拷贝数较少 1-20