一步法RT-gDNA去除qPCR预混液 Hifair® AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR

发表于2024年3月25日由上海金畔生物科技有限公司

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Hifair^® AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR是Hifair^® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR的升级版，在满足了可在同一管中进行反转录和基因组去除两个反应的同时，既简化了反应过程、大幅缩短了反应时间，又提高了反转录产物的产量。本产品4×Hifair^® AdvanceFast One-Step RT SuperMix中含反转录反应所需的全部试剂，反应时只需加入gDNA Remover Mix、模板RNA和水即可高效地合成第一链cDNA，同时去除基因组DNA污染。本产品适合具有复杂的RNA模板的反转录，也非常适合少量模板以及低拷贝基因的反转录。

本产品反转录产物兼容探针法与染料法qPCR，探针法与染料法qPCR Mix分别推荐翌圣Hieff Unicon^® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix (Cat#11211)和Hieff UNICON^® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix (Cat#11184)，进行高性能基因表达分析。本产品反转录产物不适用于后续基因克隆等长片段扩增，如果需要，推荐翌圣Hifair^® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#11149、Cat#11150)进行高效反转录。

组分信息

组分编号	组分名称	11151ES10	11151ES60
11151-A	4×Hifair^® AdvanceFast One-Step RT SuperMix	50 μL	500 μL
11151-B	gDNA Remover Mix	10 μL	100 μL
11151-C	RNase-free Water	1 mL	2×1 mL

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

在冰上融化11151-A/B/C组分，将试剂各组分充分震荡混匀，并在RNase-free离心管中配置如下体系：

组分	体积（μL）
RNase-free Water	To 20 μL
4×Hifair^® AdvanceFast One-Step RT SuperMix	5 μL
gDNA Remover Mix	1 μL
Total RNA	10 pg -5 μg*
or mRNA	10 pg-500 ng*

表1 反应体系

*建议Total RNA的投入量不超过2 μg。如果目的基因的表达丰度低，可增加投入量至最多5 μg Total RNA。

反应程序

温度	时间
37℃	5 min*
85℃	30 s

表2 反应程序

*该过程包含反转录及gDNA消化。

反转录产物可立即用于qPCR反应，也可-20°C短期保存，长期保存建议分装后于-80°C存放，避免反复冻融。

注意事项

1.所有操作均应在冰上进行，且操作过程应避免RNase污染。

2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3.本产品仅作科研用途！

Ver.CN20230530

组分信息

组分编号	组分名称	11151ES10	11151ES60
11151-A	4×Hifair^® AdvanceFast One-Step RT SuperMix	50 μL	500 μL
11151-B	gDNA Remover Mix	10 μL	100 μL
11151-C	RNase-free Water	1 mL	2×1 mL

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

在冰上融化11151-A/B/C组分，将试剂各组分充分震荡混匀，并在RNase-free离心管中配置如下体系：

组分	体积（μL）
RNase-free Water	To 20 μL
4×Hifair^® AdvanceFast One-Step RT SuperMix	5 μL
gDNA Remover Mix	1 μL
Total RNA	10 pg -5 μg*
or mRNA	10 pg-500 ng*

表1 反应体系

*建议Total RNA的投入量不超过2 μg。如果目的基因的表达丰度低，可增加投入量至最多5 μg Total RNA。

反应程序

温度	时间
37℃	5 min*
85℃	30 s

表2 反应程序

*该过程包含反转录及gDNA消化。

反转录产物可立即用于qPCR反应，也可-20°C短期保存，长期保存建议分装后于-80°C存放，避免反复冻融。

注意事项

1.所有操作均应在冰上进行，且操作过程应避免RNase污染。

2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3.本产品仅作科研用途！

Ver.CN20230530

Q：这个试剂具备颜色示踪吗？

A：组分A为蓝色，具有加样示踪的作用。

Q: 不做gDNA去除可以吗？

A: 可以，如果RNA提取时候已经处理过gDNA, 可以不加gDNA Remover Mix(组分B），反应体系用RNase-free Water补齐。
Q: 可以扩大反应体系吗？

A: 可以，参考说明书等比例扩大反应体系，注意在使用PCR仪时修改程序上的反应体积。

一步法RT-gDNA去除qPCR预混液 Hifair® AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR

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逆转录预混液(含gDNA污染去除)|RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR

发表于2024年3月24日由上海金畔生物科技有限公司

逆转录预混液(含gDNA污染去除)|RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR

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已发表文献

Hifair^® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR是Hifair^® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)的升级版，可在同一管中进行逆转录和基因组去除两个反应，操作简便，可有效降低复杂加样过程造成的样品污染和RNA降解的风险。本产品中5×Hifair^® One Step RT SuperMix中含逆转录反应所需的全部试剂（Hifair^® V Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, Oligo(dT)₁₈ Primer, Random Primer, dNTPs, Buffer)，反应时只需加入gDNA Remover Mix、模板RNA和水即可高效地合成第一链cDNA，同时去除基因组DNA污染。另外，本产品提供了5×Hifair^® One Step No-RT Control SuperMix，用于配置无逆转录酶的对照，判断qPCR模板是否来自cDNA。

本产品中的Hifair^® V Reverse Transcriptase可耐受高达60°C的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。逆转录产物兼容探针法与染料法qPCR，探针法与染料法qPCR Mix分别推荐翌圣Hieff Unicon^® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix (Cat#11211)和Hieff UNICON^® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix (Cat#11184)，进行高性能基因表达分析。

产品组分

组分编号	组分名称	产品规格
组分编号	组分名称	11142ES10 (10 T)	11142ES60 (100 T)
11142-A	5×Hifair^® One Step RT SuperMix	40 μL	400 μL
11142-B	gDNA Remover Mix	10 μL	100 μL
11142-C	5×Hifair^® One Step No-RT Control SuperMix	20 μL	40 μL
11142-D	RNase free H₂O	1 mL	2×1 mL

产品应用

后续适用于qPCR实验。

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C保存，有效期12个月。

注意事项

1）所有操作均应在冰上进行，且操作过程应避免RNase污染。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3）本产品仅作科研用途！

第一链cDNA合成操作步骤

1. 反应体系配置：在冰上融化11142-A/B/C组分，将试剂各组分充分震荡混匀，并在RNase-free离心管中配置如下体系：

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
5×Hifair^® One Step RT SuperMix	4 μL
gDNA Remover Mix	1 μL
Total RNA	10 ng-1μg

No-RT Control反应（可选）

5×Hifair^® One Step No-RT Control SuperMix，用于配置无逆转录酶的对照，判断qPCR模板是否来自cDNA。

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
5×Hifair^® One Step No-RT Control SuperMix	4 μL
gDNA Remover Mix	1 μL
Total RNA	10 ng-1μg

2. 轻轻混匀，按照如下程序进行逆转录

温度	时间
30°C	5 min
55°C	15 min
85°C	5 min

【注】：1. 逆转录温度：推荐使用55°C。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60°C。

逆转录产物可立即用于后续qPCR反应，也可-20°C短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80°C保存，避免反复冻融。

HB221019

产品组分

组分编号	组分名称	产品规格
组分编号	组分名称	11142ES10 (10 T)	11142ES60 (100 T)
11142-A	5×Hifair^® One Step RT SuperMix	40 μL	400 μL
11142-B	gDNA Remover Mix	10 μL	100 μL
11142-C	5×Hifair^® One Step No-RT Control SuperMix	20 μL	40 μL
11142-D	RNase free H₂O	1 mL	2×1 mL

产品应用

后续适用于qPCR实验。

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C保存，有效期12个月。

注意事项

1）所有操作均应在冰上进行，且操作过程应避免RNase污染。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3）本产品仅作科研用途！

第一链cDNA合成操作步骤

1. 反应体系配置：在冰上融化11142-A/B/C组分，将试剂各组分充分震荡混匀，并在RNase-free离心管中配置如下体系：

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
5×Hifair^® One Step RT SuperMix	4 μL
gDNA Remover Mix	1 μL
Total RNA	10 ng-1μg

No-RT Control反应（可选）

5×Hifair^® One Step No-RT Control SuperMix，用于配置无逆转录酶的对照，判断qPCR模板是否来自cDNA。

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
5×Hifair^® One Step No-RT Control SuperMix	4 μL
gDNA Remover Mix	1 μL
Total RNA	10 ng-1μg

2. 轻轻混匀，按照如下程序进行逆转录

温度	时间
30°C	5 min
55°C	15 min
85°C	5 min

【注】：1. 逆转录温度：推荐使用55°C。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60°C。

逆转录产物可立即用于后续qPCR反应，也可-20°C短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80°C保存，避免反复冻融。

HB221019

Q: 反转录后的产物是什么？是双链的DNA吗？

A：反转录后的产物是RNA和cDNA的杂交链，并不是DNA双链，其稳定性相较于后者来说要低一些。

[1] Ji C, Li J, Jiang C, et al. Zinc and nitrogen synergistic act on root-to-shoot translocation and preferential distribution in rice. J Adv Res. 2021;35:187-198. Published 2021 Apr 20. doi:10.1016/j.jare.2021.04.005(IF:10.479)

OnePot cDNA和gDNA文库制备试剂盒 cDNA & gDNA Library Prep Kit

发表于2024年3月17日由上海金畔生物科技有限公司

OnePot cDNA和gDNA文库制备试剂盒 cDNA & gDNA Library Prep Kit

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已发表文献

Hieff NGS^® OnePot cDNA & gDNA Library Prep Kit是针对Illumina^®或者MGI^®测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容cfDNA样本的建库。该试剂盒使用了最新优化的连接酶，改善了接头连接时的片段自连现象，同时替换了新型高保真酶，进一步提升了扩增的均一性和保真性。

Ø 适用500 pg-1 μg的基因组DNA、全长cDNA（衔接Hieff NGS^® ds-cDNA Synthesis Kit全长cDNA合成试剂盒（Yeasen Cat#13488））等样本；
Ø 高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段无偏好性；
Ø 片段化、末端修复/加A一步完成；
Ø 强扩增效率的高保真酶，显著提高文库质量及产量；
Ø 适用于cfDNA样本；
Ø 严格的批次性能与稳定性质控；

产品组分

组分编号组分名称		13502ES24	13502ES96
13502-A	Smearase Buffer	240 μL	960 μL
13502-B	DNA Extra-working Buffer	240 μL	960 μL
13502-C	Smearase Enzyme Mix	120 μL	480 μL
13502-D	Ligation Enhancer	720 μL	2×1440 μL
13502-E	Novel T4 DNA Ligase	120 μL	480 μL
13502-F	2× Ultima HF Amplification Mix	600 μL	2×1200 μL

运输与保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

注意事项
一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
7. 本产品仅作科研用途！

二、关于接头连接（Adapter Ligation）

Illumina接头：

1. 本公司可提供短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

目前有双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 （Cat#12412~Cat#12413）。

2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的DNA或者RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM，接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA/DNA量与接头使用浓度推荐表

Input Total RNA（参照Cat#13488 RNA投入量）	Adapter stock concentration	Input Total DNA	Adapter stock concentration
≥10 ng	15 μM	1μg~200 ng	15 μM
<10 ng	3 μM	100 ng	10 μM
		50 ng	5 μM
		10 ng	3 μM
		5 ng	1μM
		≤1ng	0.5μM

三、关于文库扩增（Library Amplification）

文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1mg文库的推荐循环数。

表 2 Input Total RNA或者DNA量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles	Input Total DNA	Number of cycles
<1 ng	10~12	<1 ng	14~16
1ng	9~10	1 ng	13~14
10 ng	6~7	5 ng	10~11
50ng	4~5	10 ng	9~10
100~1000 ng	4	50 ng	7~8
		100 ng	6~7
		200 ng	5~6

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

四、DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

六、自备材料（Other Material）

1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效产品。

2. Adapters：含Index的长接头（Yeasen Cat#12615~12618）或者无Index的短接头试剂盒（Yeasen Cat#12611~12614）。

3. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

4. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

建库流程图

OnePot cDNA和gDNA文库制备试剂盒 cDNA & gDNA Library Prep Kit

图1 DNA建库操作流程

使用方法

Step 1 cDNA & gDNA片段化/末端修复/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

该步骤将cDNA & gDNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表3中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表3反应体系。

表3 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

名称	体积（μL）	名称	体积（μL）
2nd Strand cDNA	35	gDNA	35
Smearase Buffer	10	Smearase Buffer	10
Smearase Enzyme Mix	5	Smearase Enzyme Mix	5
RNase-free H₂O	10	DNA Extra-working Buffer	10
Total	60	Total	60

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表4所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表4 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

温度	时间
热盖105°C	on
4°C	1 min
30 °C	5–20 min**
72 °C	20 min
4°C	Hold

【注】：*DNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4°C，待模块温度降至4°C时，将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表5。

表5 片段化时间选择表

插入片段主峰大小	片段化时间
300~500 bp	5 min
250 bp	10 min
200 bp	15 min
150 bp	20~30 min

OnePot cDNA和gDNA文库制备试剂盒 cDNA & gDNA Library Prep Kit

图2 不同片段化条件下的文库峰形参考

Step 2 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina^®或者MGI^®接头。

1. 参考注意事项二中的表1，根据Input DNA，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表6中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于Step 1步骤结束后的PCR管中继续配制表6所示反应体系。

表6 Adapter Ligation体系

名称	体积（μL）
dA-tailed DNA	60
Ligation Enhancer	30*
Novel T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**
Total	100

【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
**本公司Illumina接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表7所示反应程序，进行接头连接反应：

表7 Adapter Ligation反应程序

温度	时间
热盖	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

Step 3连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.45×，Beads:DNA=0.45:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，用10 μL移液器吸干净残留液体，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

Step 4 文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表8中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表8所示反应体系。
表8 短接头连接产物PCR反应体系（Illumina扩增体系）

组分名称	体积（μL）
2× Ultima HF Amplification Mix	25
Universal Primer/ i5 Primer*	2.5
Index Primer/ i7 Primer*	2.5
Adapter Ligated DNA	20
Total	50

【注】：*使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂（Cat#12412~Cat#12413）中配备的Index primer进行扩增。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表9示反应程序，进行PCR扩增。

表9 PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	参照注意事项三，文库扩增
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	1 min	1
4°C	Hold	–

Step 5 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，用10 μL移液器吸干净残留液体，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入32 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取30 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

Step 6 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

HB220810

产品组分

组分编号组分名称		13502ES24	13502ES96
13502-A	Smearase Buffer	240 μL	960 μL
13502-B	DNA Extra-working Buffer	240 μL	960 μL
13502-C	Smearase Enzyme Mix	120 μL	480 μL
13502-D	Ligation Enhancer	720 μL	2×1440 μL
13502-E	Novel T4 DNA Ligase	120 μL	480 μL
13502-F	2× Ultima HF Amplification Mix	600 μL	2×1200 μL

运输与保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

注意事项
一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

二、关于接头连接（Adapter Ligation）

Illumina接头：

1. 本公司可提供短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

目前有双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 （Cat#12412~Cat#12413）。

3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

表1 Input Total RNA/DNA量与接头使用浓度推荐表

Input Total RNA（参照Cat#13488 RNA投入量）	Adapter stock concentration	Input Total DNA	Adapter stock concentration
≥10 ng	15 μM	1μg~200 ng	15 μM
<10 ng	3 μM	100 ng	10 μM
		50 ng	5 μM
		10 ng	3 μM
		5 ng	1μM
		≤1ng	0.5μM

三、关于文库扩增（Library Amplification）

表 2 Input Total RNA或者DNA量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles	Input Total DNA	Number of cycles
<1 ng	10~12	<1 ng	14~16
1ng	9~10	1 ng	13~14
10 ng	6~7	5 ng	10~11
50ng	4~5	10 ng	9~10
100~1000 ng	4	50 ng	7~8
		100 ng	6~7
		200 ng	5~6

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

四、DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

六、自备材料（Other Material）

1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效产品。

2. Adapters：含Index的长接头（Yeasen Cat#12615~12618）或者无Index的短接头试剂盒（Yeasen Cat#12611~12614）。

3. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

4. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

建库流程图

OnePot cDNA和gDNA文库制备试剂盒 cDNA & gDNA Library Prep Kit

图1 DNA建库操作流程

使用方法

Step 1 cDNA & gDNA片段化/末端修复/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

该步骤将cDNA & gDNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表3中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表3反应体系。

表3 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

名称	体积（μL）	名称	体积（μL）
2nd Strand cDNA	35	gDNA	35
Smearase Buffer	10	Smearase Buffer	10
Smearase Enzyme Mix	5	Smearase Enzyme Mix	5
RNase-free H₂O	10	DNA Extra-working Buffer	10
Total	60	Total	60

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表4所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表4 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

温度	时间
热盖105°C	on
4°C	1 min
30 °C	5–20 min**
72 °C	20 min
4°C	Hold

表5 片段化时间选择表

插入片段主峰大小	片段化时间
300~500 bp	5 min
250 bp	10 min
200 bp	15 min
150 bp	20~30 min

OnePot cDNA和gDNA文库制备试剂盒 cDNA & gDNA Library Prep Kit

图2 不同片段化条件下的文库峰形参考

Step 2 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina^®或者MGI^®接头。

1. 参考注意事项二中的表1，根据Input DNA，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表6中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于Step 1步骤结束后的PCR管中继续配制表6所示反应体系。

表6 Adapter Ligation体系

名称	体积（μL）
dA-tailed DNA	60
Ligation Enhancer	30*
Novel T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**
Total	100

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表7所示反应程序，进行接头连接反应：

表7 Adapter Ligation反应程序

温度	时间
热盖	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

Step 3连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.45×，Beads:DNA=0.45:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，用10 μL移液器吸干净残留液体，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

Step 4 文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表8中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表8所示反应体系。
表8 短接头连接产物PCR反应体系（Illumina扩增体系）

组分名称	体积（μL）
2× Ultima HF Amplification Mix	25
Universal Primer/ i5 Primer*	2.5
Index Primer/ i7 Primer*	2.5
Adapter Ligated DNA	20
Total	50

【注】：*使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂（Cat#12412~Cat#12413）中配备的Index primer进行扩增。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表9示反应程序，进行PCR扩增。

表9 PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	参照注意事项三，文库扩增
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	1 min	1
4°C	Hold	–

Step 5 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，用10 μL移液器吸干净残留液体，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

Step 6 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

HB220810

OnePot cDNA和gDNA文库制备试剂盒 cDNA & gDNA Library Prep Kit

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cDNA第一链合成试剂盒(含有gDNA去除)|1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

发表于2024年3月15日由上海金畔生物科技有限公司

cDNA第一链合成试剂盒(含有gDNA去除)|1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述

Hifair^® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair^®Ⅱ Reverse Transcriptase而开发。该酶热稳定性大幅度提高，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^®Ⅱ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6 和oligo (dT)₁₈，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格 11121ES60 (100 T)
11121-A	RNase-free H₂O	2×1 mL
11121-B	5×gDNA digester Buffer	200 μL
11121-C	gDNA digester	100 μL
11121-D	5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus	400 μL
11121-E	Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix	200 μL
11121-F	Oligo (dT)₁₈(50 μM)	100 μL
11121-G	Random Primers N6 (50 μM)	100 μL

【注】：

1）5×Hifair^® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制剂和dNTP。

2）Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

2）建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

3）可以不经过基因组去除步骤，直接进行逆转录，这样所得到的结果与使用Hifair^® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat#11119）效果一致。但是请勿将gDNA digester与11119ES中的5×Hifair^®Ⅱ Buffer配套使用，因其不含终止gDNA去除反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

关于逆转录引物的选择

1）如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。
3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

4）使用Random primers N6，进行2 kb以下的cDNA合成时，Random primers N6的使用量为 1-2 μL；2 kb 以上的cDNA合成时，Random primers N6 的使用量为0.4-1 μL。

第一链cDNA合成操作步骤

一、若实验需要去除残留基因组DNA

1. 在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 10 μL
5× gDNA digester Buffer	2 μL
gDNA digester	1 μL
Total RNA	1 ng -5 μg*
or mRNA	1 ng-500 ng*

【注】：* 若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为1 ng -1 μg；mRNA的投入量为1 ng-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 μg Total RNA或500 ng mRNA。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
上一步的反应液	10 μL
5× Hifair^®Ⅱ Buffer plus	2 μL*
Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)₁₈(50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM)	or 1 μL
or Oligo (dT)₁₈(50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM)	or 1 μL

【注】：

1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈1:1混合使用。

2）5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因gDNA digester buffer的影响，本体系中只需要加2 μL。

3）建议先加入5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus混匀后再添加反转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3. 逆转录程序设置

温度	时间
25℃	5 min
42℃	30 min
85℃	5 min

【注】：逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。

4. 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

二、若实验无需去除基因组DNA

1. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
Total RNA	1 ng -5 μg
or mRNA	1 ng-500 ng
5× Hifair^®Ⅱ Buffer plus	4 μL*
Oligo (dT)₁₈(50 μM) or Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL

【注】：

1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈1:1混合使用。

2）5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因无gDNA digester buffer的影响，本体系中需要添加4 μL。

【可选步骤】：针对复杂模板，建议RNA、H₂O、反转录引物在65℃保温5 min后，冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶和Buffer。

2. 逆转录程序设置参照上述基因组去除后的逆转录程序。

HB220607

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产品描述

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格 11121ES60 (100 T)
11121-A	RNase-free H₂O	2×1 mL
11121-B	5×gDNA digester Buffer	200 μL
11121-C	gDNA digester	100 μL
11121-D	5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus	400 μL
11121-E	Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix	200 μL
11121-F	Oligo (dT)₁₈(50 μM)	100 μL
11121-G	Random Primers N6 (50 μM)	100 μL

【注】：

1）5×Hifair^® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制剂和dNTP。

2）Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

2）建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途！

关于逆转录引物的选择

4）使用Random primers N6，进行2 kb以下的cDNA合成时，Random primers N6的使用量为 1-2 μL；2 kb 以上的cDNA合成时，Random primers N6 的使用量为0.4-1 μL。

第一链cDNA合成操作步骤

一、若实验需要去除残留基因组DNA

1. 在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 10 μL
5× gDNA digester Buffer	2 μL
gDNA digester	1 μL
Total RNA	1 ng -5 μg*
or mRNA	1 ng-500 ng*

【注】：* 若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为1 ng -1 μg；mRNA的投入量为1 ng-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 μg Total RNA或500 ng mRNA。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
上一步的反应液	10 μL
5× Hifair^®Ⅱ Buffer plus	2 μL*
Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)₁₈(50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM)	or 1 μL
or Oligo (dT)₁₈(50 μM) or Gene Specific Primers (2 μM)	or 1 μL

【注】：

1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈1:1混合使用。

2）5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因gDNA digester buffer的影响，本体系中只需要加2 μL。

3）建议先加入5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus混匀后再添加反转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3. 逆转录程序设置

温度	时间
25℃	5 min
42℃	30 min
85℃	5 min

【注】：逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。

4. 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

二、若实验无需去除基因组DNA

1. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
RNase-free H₂O	To 20 μL
Total RNA	1 ng -5 μg
or mRNA	1 ng-500 ng
5× Hifair^®Ⅱ Buffer plus	4 μL*
Oligo (dT)₁₈(50 μM) or Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
Hifair^® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL

【注】：

1）逆转录引物：荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈1:1混合使用。

2）5×Hifair^®Ⅱ Buffer plus加入量（*）：因无gDNA digester buffer的影响，本体系中需要添加4 μL。

【可选步骤】：针对复杂模板，建议RNA、H₂O、反转录引物在65℃保温5 min后，冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶和Buffer。

2. 逆转录程序设置参照上述基因组去除后的逆转录程序。

HB220607

Q：如果做lncRNA 的 qPCR 的话，逆转录这步 oligodT 和random 引物是不是都得加？

A：是的，有的 lncRNA 含有A 尾，有的不含，所以这两种引物都要加。

Q：是否能用来做 miRNA 的逆转录。

A：可以，用茎环法。

Q：11121/11139，miRNA 的投入量推荐多少？

A：不同 miRNA 表达丰度不同，建议尽量投入 0.5-1 μg miRNA。

Q：可以用来做 lncRNA 和 circRNA 吗？

A：可以做 circRNA 和无尾的lncRNA。

Q：客户后续构建质粒的逆转录试剂盒和跑 qpcr 逆转录的有啥区别吗，用的逆转录试剂盒要不一样吗，不都是逆转录出来 cdna 吗？

A：mix 和 kit 逆转录长度不同的，这个推荐用 11121 和 11139。

qPCR第一链cDNA合成即用型预混液(含有gDNA去除)|1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)

发表于2024年3月15日由上海金畔生物科技有限公司

qPCR第一链cDNA合成即用型预混液(含有gDNA去除)|1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述

Hifair^® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)基于Hifair^® Ⅱ Reverse Transcriptase而开发的即用型预混液。该酶的热稳定性大幅度提高，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。

该预混液包含gDNA digester和2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus。gDNA digester可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus含有逆转录反应所需的所有组分（Buffer，dNTP，Hifair^®Ⅱ Reverse Transcriptase，RNase inhibitor，Random primers/ Oligo (dT)₁₈ primer mix），只需加入RNA模板和 RNase-free ddH₂O即可进行逆转录反应，并同时终止gDNA digester的作用，保证cDNA的完整性。

该产品适用于两步法RT-qPCR检测，针对qPCR进行Random primers/ Oligo (dT)₁₈ primer的比例优化，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始，并具有相同的逆转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。逆转录产物兼容SYBR^®Green和探针法qPCR，可以根据实验目的，选择UNICON^® qPCR SYBR^® Green Master Mix，Hieff^® qPCR SYBR^® Green Master Mix或Hieff^® qPCR TaqMan Probe Master Mix等试剂配合使用，进行高性能的基因表达分析。

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
编号	组分	11123ES10 (10 T)	11123ES60 (100 T)
11123-A	RNase-free ddH₂O	1 mL	2×1 mL
11123-B	5×gDNA digester Buffer	20 μL	200 μL
11123-C	gDNA digester	10 μL	100 μL
11123-D	2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus	100 μL	1 mL

【注】：2×Hifair^®Ⅱ SuperMix plus含有gDNA digester抑制剂。

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期18个月。

注意事项

1）gDNA digester和2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心，吹打混匀。

2）建议RNA是溶于水而不是TE Buffer中，因为TE Buffe会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

3）可以不经过基因组去除步骤，直接进行逆转录，这样所得到的结果与使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (Cat No. 11120ES) 效果一致。但是请勿将gDNA digester与11120ES中的2×Hifair® Ⅱ SuperMix配套使用，因其不含终止gDNA digester反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验。

4）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

5) 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

6) 本产品仅作科研用途！

第一链cDNA合成操作步骤

1. 残留基因组DNA去除

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃ 孵育2 min。

组分	使用量
RNase free ddH₂O	To 10 μL
5×gDNA digester Buffer	2 μL
gDNA digester	1 μL
Total RNA	1 ng -5 μg*
or mRNA	1 ng-500 ng*

【注】：* 20 μL逆转录反应体系建议Total RNA的投入量不超过1 μg。如果目的基因的表达丰度低，最多投入5 μg Total RNA，否则RNA投入量过高，可能会超过后续定量PCR的线性范围。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

在第1步的反应管中直接加入2×Hifair^TM Ⅱ SuperMix plus，用移液器轻轻吹打混匀。

组分	使用量
第1步的反应液	10 μL
2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus	10 μL

3. 逆转录程序设置

标准程序（适用于微量和常规量的模板量）

温度	时间
25℃	5 min
42℃	30 min
85℃	5 min

【注】：逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。

4. 逆转录产物可立即用于qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

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产品名称	货号	规格
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Hifair^® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)	11121ES60	100 T
Hifair^® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	11141ES60	100 T
Hifair^® qPCR SYBR^® Green Master Mix (No Rox )	11201ES08	5 mL
Hifair^® qPCR SYBR^® Green Master Mix (Low Rox Plus)	11202ES08	5 mL
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Hieff UNICON^® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法，No Rox)	11195ES08	5 mL
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HB210628

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产品描述

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
编号	组分	11123ES10 (10 T)	11123ES60 (100 T)
11123-A	RNase-free ddH₂O	1 mL	2×1 mL
11123-B	5×gDNA digester Buffer	20 μL	200 μL
11123-C	gDNA digester	10 μL	100 μL
11123-D	2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus	100 μL	1 mL

【注】：2×Hifair^®Ⅱ SuperMix plus含有gDNA digester抑制剂。

运输和保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期18个月。

注意事项

1）gDNA digester和2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心，吹打混匀。

2）建议RNA是溶于水而不是TE Buffer中，因为TE Buffe会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

4）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

5) 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

6) 本产品仅作科研用途！

第一链cDNA合成操作步骤

1. 残留基因组DNA去除

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃ 孵育2 min。

组分	使用量
RNase free ddH₂O	To 10 μL
5×gDNA digester Buffer	2 μL
gDNA digester	1 μL
Total RNA	1 ng -5 μg*
or mRNA	1 ng-500 ng*

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

在第1步的反应管中直接加入2×Hifair^TM Ⅱ SuperMix plus，用移液器轻轻吹打混匀。

组分	使用量
第1步的反应液	10 μL
2×Hifair^® Ⅱ SuperMix plus	10 μL

3. 逆转录程序设置

标准程序（适用于微量和常规量的模板量）

温度	时间
25℃	5 min
42℃	30 min
85℃	5 min

【注】：逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。

4. 逆转录产物可立即用于qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

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产品名称	货号	规格
Hifair^® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit	11119ES60	100 T
Hifair^® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix	11120ES60	100 T
Hifair^® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)	11121ES60	100 T
Hifair^® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	11141ES60	100 T
Hifair^® qPCR SYBR^® Green Master Mix (No Rox )	11201ES08	5 mL
Hifair^® qPCR SYBR^® Green Master Mix (Low Rox Plus)	11202ES08	5 mL
Hifair^® qPCR SYBR^® Green Master Mix (High Rox Plus)	11203ES08	5 mL
Hieff UNICON^® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法，No Rox)	11195ES08	5 mL
Hieff UNICON^® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法，Low Rox)	11196ES08	5 mL
Hieff UNICON^® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法，High Rox)	11197ES08	5 mL
Hieff UNICON^® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法，No Rox)	11198ES08	5 mL
Hieff UNICON^®qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法，Low Rox)	11199ES08	5 mL
Hieff UNICON^® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法，High Rox)	11200ES08	5 mL
Hieff UNICON^® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix	11184ES08	5 mL

HB210628

Q：逆转录产品如何选择？

A：参考下表。

产品名称/货号	产品形式	引物	适用实验类型	产品特点/适用范围（A/B）
Hifair™ II Reverse Transcriptase 第二代耐热逆转录酶 11110ES	单酶	无	☑cDNA产物后续用于PCR ☑cDNA产物后续用于qPCR	A．常规表达丰度RNA逆转录（总RNA 1ng-5μg）
Hifair™ III Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶 11111ES				B.低表达丰度RNA逆转录（总RNA 10pg-5μg）；复杂RNA
Hifair™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 11119ES/11121ES	酶和Buffer分开	单独成管的Oligo dT 、Random primer		同A
Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit 11135ES/11139ES				同B
Hifair™ II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 11120ES/11123ES	酶和Buffer预混	按比例预混的Oligo dT 、Random primer	☑cDNA产物后续用于qPCR	同A
Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 11137ES/11141ES				同B

Q：逆转录引物如何选择？

A：11123ES中使用的是Random Primers和oligo dT按照一定优化的比例预混引物。

Q：反转录产物可以做普通PCR吗？

A：不推荐。11123ES以预混液形式提供，预混液中包含Oligo (dT)与Random Primers混合引物，逆转录产物反转均一，但长度较短，可以做短片段，过长的不适合。若反转录产物后续进行PCR，建议用翌圣11121ES，引物选oligo dT。

Q：逆转录产物后续进行qPCR，需要稀释吗？

A：建议稀释5-10倍。目的有二：一、提高稀释倍数，降低移液误差，提高实验重复性；二、降低逆转录体系中高浓度某些成分对下游qPCR反应的抑制作用。

Q：该产品可以搭配其他品牌的定量试剂使用吗？

A：可以。逆转录产物进行稀释后，反转录相关组分对后续不同品牌的qPCR试剂影响非常小。

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