Hieff NGS® OnePot Pro DNA Fragmentation Reagent是针对Illumina®与MGI®高通量测序平台设计的新一代酶切法建库试剂。本品采用高质量的片段化酶,摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,将片段化模块与末端修复/加A模块合二为一,极大的降低了建库的时间和成本。可应用于500 pg-1 μg常规动植物基因组、微生物基因组等样本,在单管内实现DNA的片段化、末端修复和A尾添加反应。反应产物无需纯化,即可使用Hieff NGS® Fast-PaceTM DNA Ligation Module(Cat#12607)或Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module(Cat#12626)进行文库构建中接头连接反应。
产品组分
组分编号
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组分名称
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24 T
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96 T
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12619-A
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Smearase® Buffer
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240 μL
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960 μL
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12619-B
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Smearase® Enzyme
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120 μL
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480 μL
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运输与保存方法
干冰运输。-25~-15℃保存,有效期18个月。
注意事项
1. 本试剂盒兼容范围为500 pg – 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。
2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在TE(10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA,pH 8.0)中进行片段化。
表1 常规基因组DNA片段化时间选择表
插入片段主峰大小
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片段化时间
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优化范围
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600 bp
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8 min
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6-12 min
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350 bp
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10 min
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8-14 min
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250 bp
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12 min
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10-15 min
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200 bp
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15 min
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13-18 min
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150 bp
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20 min
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15-25 min
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表2 FFPE DNA片段化时间选择表
插入片段主峰大小
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片段化时间
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DIN*
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250 bp
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9-13 min
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> 8.0
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250 bp
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8-11 min
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6.5-8.0
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250 bp
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4-8 min
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4.2-6.5
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250 bp
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3-6 min
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2.5-4.2
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【注】:*DIN为DNA Integrity Number,是用Agilent 2200来定义FFPE DNA降解程度的一种方法。
3. 对于常规的高质量基因组DNA,酶切时间参考表1,本试剂盒片段化偏好低,耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本,酶切时间参考表2。以上为推荐时间,需客户在自己的实验体系中进行微调,以达到最佳效果。
4. 参照片段化步骤推荐条件可将DNA酶切为所需大小,为保证优质稳定的片段化效果,片段化过程请于冰上操作。
5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
DNA片段化/末端修复/dA尾添加(DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing)
该步骤将基因组DNA片段化,同时进行末端修复及dA尾添加。
1. 将表3中试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于冰上配制表3反应体系。
表3 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系
名称
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体积(μL)
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Input DNA
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x
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Smearase® Buffer
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10
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Smearase® Enzyme
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5
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TE
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Up to 60 μL
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3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表4所示反应程序,进行DNA片段化,末端修复及dA尾添加反应。
表4 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序
温度
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时间
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热盖105°C
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On
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4 °C
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1 min*
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30 °C
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3-20 min**
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65 °C
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20 min
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4 °C
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Hold
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【注】:*DNA片段化过程为有效控制片段化效果,避免过度酶切,反应程序可预先设置4℃,待模块温度降至4℃时,将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA,酶切时间参考表1,Input DNA 500-1000 ng,可根据具体需求,适当延长酶切时间2-4 min左右;对于质量不一的FFPE DNA样本,酶切时间参考表2。
5. 产物如需纯化,可使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)或AMPure XP Beads(Cat#A63880)或其他等效产品。也可以直接驳接Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module(Cat#12626)或Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module(Cat#12607)试剂盒,进行接头连接。详细说明请见后者的说明书。
参考实例
使用Hieff NGS® OnePot Pro DNA Fragmentation Reagent对200 ng Human gDNA (NA12878) 样本进行酶切建库检测,片段化结果见图1。
图1 OnePot Pro DNA建库试剂盒酶切200 ng Human gDNA样本(不同酶切时间片段化效果检测)
HB230215