KAMIYA KT-26867说明书
KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY
人蛋白零点，髓鞘 (MPZ) ELISA
用于定量测定组织匀浆、细胞培养上清液和其他生物体液中的人 MPZ
目录号编号KT-26867
仅供研究使用。不得用于诊断程序。
产品信息
人蛋白零点，髓鞘 (MPZ) ELISA
目录号编号KT-26867
Human Protein Zero, Myelin
(MPZ) ELISA
预期用途
该试剂盒是一种夹心酶免疫分析法，用于体外定量测定组织匀浆、细胞培养上清液和其他生物体液中的人 MPZ。仅供研究使用。不适用于 用于诊断程序。
组件
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试剂 |
数量 |
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预包被、即用型 96 孔板条板 |
1 |
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校准品（冻干） |
2 |
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校准品稀释液 |
1 × 20 mL |
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检测试剂 A |
1 × 120 µL |
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检测试剂 B |
1 × 120 µL |
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试验稀释剂 A（2X 浓缩液） |
1 × 6 mL |
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试验稀释剂 B（2X 浓缩液） |
1 × 6 mL |
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TMB 底物 |
1 × 9 mL |
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终止液 |
1 × 6 mL |
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清洗缓冲液（30X 浓缩液） |
1 × 20 mL |
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96 孔封板膜 |
4 |
需要但未提供的材料
- 带有 450±10 nm 滤光片的酶标仪。
- 精密单通道和多通道移液器和一次性吸头。
- 用于稀释样品的 Eppendorf 管。
- 去离子水或蒸馏水。
- 吸水纸吸干微量滴定板。
- 清洗液容器。
储存
所有试剂应根据小瓶上的标签进行保存。接收后，校准品、检测试剂 A、检测试剂 B 和 96 孔板条应储存在-20 ℃。未使用的试剂条应保存在密封袋中，并提供干燥剂，以尽量减少暴露于潮湿空气中。开封的检测试剂盒将在所示失效日期前保持稳定，前提是其按照上述规定储存。
原理
该试剂盒中提供的微量滴定板已用 MPZ 特异性抗体预包被。然后将校准品或样品加入到含有 MPZ 特异性生物素结合抗体制剂的适当微量滴定板孔中。然后，向每个微孔板小孔中加入与辣根过氧化物酶 (HRP) 结合的抗生物素蛋白并孵育。然后向各孔中加入 TMB 底物溶液。只有那些含有 MPZ、生物素偶联抗体和酶偶联抗生物素蛋白的孔才会出现颜色变化。
加入硫酸溶液终止酶-底物反应，并采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波长处测定颜色变化。然后通过比较样品的 O.D. 值与校准曲线，测定样品中 MPZ 的浓度。
样本采集和储存
组织匀浆
组织匀浆的制备因组织类型而异。对于本试验，在冰冷 PBS (0.02 mol/L，pH 7.0-7.2) 中冲洗组织，以*除去过量血液，并在匀浆前称重。将组织制成小块，置于冰上，用玻璃匀浆器在 5-10 mL PBS 中匀浆化（Micro tissue Grinders 也工作）。用超声细胞破碎仪对所得混悬液进行超声处理或进行两次冻融循环以进一步破碎细胞膜。然后，将匀浆在 5,000 xg 下离心 5 min。立即除去上清液并进行试验，或等分并储存在≤-20 ℃ 下。
细胞培养上清液和其他生物体液
以 1,000 xg 离心样品 20 min。立即除去微粒并进行测定，或将样品等分试样储存在-20 ℃ 或-80 ℃ 下备用。避免反复冻融循环。
注：
1. 5 天内使用的样品可在 4 ℃ 下储存，否则样品必须在-20 ℃（≤1 个月）或-80 ℃（≤2 个月）下储存，以避免生物活性损失和污染。
- 样本溶血会影响结果，因此溶血标本无法检出。
- 进行分析时，将样品缓慢恢复至室温。
试剂制备
使用前，将所有试剂盒组分和样本置于室温 (18-25 ℃) 下。
校准品
用 0.1 mL 校准品稀释液复溶校准品，在室温下保持 10 min，轻轻振摇（不要起泡）。储备液中校准品的浓度为 10 ng/mL。请制备 7 支含 0.5 mL 校准品稀释液的试管，并根据下图制备双倍稀释系列。在下一次转移前，充分混合各试管。设置 7 个点的稀释校准品，如 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL，后一个含有校准品稀释液的 EP 管作为空白 (0 ng/mL)。
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管 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
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ng/mL |
10 |
5 |
2.5 |
1.25 |
0.625 |
0.312 |
0.156 |
0 |
试验稀释剂 A 和 B
用 6 mL 去离子水或蒸馏水稀释 6 mL 试验稀释剂 A 或 B 浓缩液 (2X)，制备 12 mL 试验稀释剂 A 或 B。制备的工作稀释液不能冷冻。
检测试剂 A 和 B
使用前短暂旋转或离心储备检测试剂 A 和检测试剂 B。分别用工作试验稀释剂 A 或 B 稀释至工作浓度 (1:100)。
清洗溶液
用 580 mL 去离子水或蒸馏水稀释 20 mL 清洗液浓缩液 (30X)，制备 600 mL 清洗液 (1X)。
TMB 底物
用无菌吸头吸取所需剂量的溶液，不得将残留溶液再次倒入小瓶中。
注：
1. 不允许在孔中直接进行连续稀释。
2. 在测定前 15 min 内制备校准品。请勿在 37 ℃ 下直接溶解试剂。
- 请按照说明仔细复溶校准品或工作检测试剂 A 和 B，避免起泡并轻轻混合，直至晶体*溶解。为尽量减少移液引起的不精密度，应使用小体积并确保移液器经过校准。建议抽吸 10µL 以上，用于一次移液。
4. 复溶的校准品、检测试剂 A 和检测试剂 B 只能使用一次。
5. 如果在清洗溶液浓缩液 (30X) 中形成晶体，则加热至室温并轻轻混合，直至晶体*溶解。
6. 试剂配制用水或容器受污染会影响检测结果。
样品制备
- Kamiya Biomedical Company 仅对试剂盒本身负责，不对检测过程中消耗的样本负责。用户应计算整个测试中可能使用的样本数量。请提前预留足够的样本。
2. 请在测定前预测浓度。如果这些值不在校准曲线范围内，则用户必须确定其特定实验的宜样本稀释度。
3. 如果手册中未指明样本，则需要进行初步实验以确定试剂盒的有效性。
4. 用化学裂解缓冲液制备的组织或细胞提取样品，由于某些化学物质的影响，可能会引起意想不到的 ELISA 结果。
- 由于其他来源的抗原可能与我们试剂盒中使用的抗体不匹配（例如，抗体靶向构象表位而不是线性表位），我们的产品可能无法识别其他生产商的一些天然或重组蛋白。
6. 受细胞活性、细胞数量和取样时间等因素的影响，试剂盒可能无法检测细胞培养上清液样本。
7. 建议使用未经长期储存的新鲜样本进行试验。否则，这些样品可能发生蛋白质降解和变性，终导致错误的结果。
试验程序
- 测定稀释校准品、空白和样本孔。校准品制备 7 孔，空白制备 1 孔。向适当孔中分别加入 100µL 校准品稀释液（读取试剂制备液）、空白和样本。用封板覆膜覆盖。在 37 ℃ 下孵育 2 小时。
2. 清除每个孔中的液体，不要清洗。
- 向各孔中加入 100µL 检测试剂 A 工作溶液。用封板覆膜覆盖后，在 37 ℃ 下孵育 1 小时。
- 吸取溶液，使用喷射瓶、多通道移液器、歧管分配器或自动清洗器用 350µL 1X 清洗液清洗每个孔，静置 1-2 min。通过将平板卡在吸水纸上，*去除所有孔中的剩余液体。重复 3 次。后一次洗涤后，通过抽吸或倾析去除任何剩余的洗涤缓冲液。倒置平板，在吸水纸上吸干。
- 向各孔中加入 100µL 检测试剂 B 工作溶液。用封板覆膜覆盖后，在 37 ℃ 下孵育 30 min。
6. 按照步骤 4 重复抽吸/清洗过程 5 次。
- 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新的封板机盖住。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min（不得超过 30 min）。避光保存。加入底物溶液后，液体将变为蓝色。
- 向各孔中加入 50µL 终止液。加入终止液后，液体将变为黄色。轻敲微孔板一侧，混匀液体。如果颜色变化不均匀，轻敲平板以确保充分混合。
- 除去任何一滴水和平板底部的指纹，并确认液体表面无气泡。然后，运行酶标仪，立即在 450 nm 处测定。
注：
- 试验制备：保留适当数量的条带用于 1 次实验，并从微量滴定板中取出额外的条带。取出的试剂条应重新密封，并在-20 ℃ 下储存，直至试剂盒失效日期。
- 样本或试剂添加：请使用新鲜制备的校准品。请小心地将样品加入孔中，并轻轻混合以避免起泡。尽可能不要接触孔壁。对于程序中的每个步骤，将试剂或样本添加到测定板的总分配时间不应超过 10 min。这将确保每个移液步骤的运行时间相等，不会中断。尽管不要求，但建议重复检测所有校准品和标本。为避免交叉污染，在每个校准品水平添加之间、样本添加之间和试剂添加之间更换移液器吸头。此外，每种试剂使用单独的储液器。
- 孵育：为确保结果准确，孵育步骤期间必须适当粘附封板覆膜。在各孵育步骤之间，请勿使微孔长时间处于未覆盖状态。试剂加入微孔板条后，在检测过程中的任何时间都不要让板条变干。必须观察培养时间和温度。
- 清洗：清洗程序至关重要。每个步骤*去除液体对于良好性能至关重要。后一次清洗后，通过抽吸或倾倒除去任何剩余的清洗液，并除去平板底部的水滴和指纹。清洗不充分将导致精密度较差和吸光度读数假性升高。
- 反应时间的控制：观察加入 TMB 底物后颜色的变化（如 10 min 观察一次），如颜色过深，应提前加入终止液，避免反应过强而导致吸光度读数不准确。
6. TMB 底物容易被污染。请避光保存。
7. 小于 60% 的环境湿度可能会对终性能产生一些影响，因此，建议在该条件下使用湿化器。
结果计算
计算各校准品、质控品和样本重复两次读数的平均值，并减去平均零校准品光密度。在 log-log 图形纸上创建校准曲线，y 轴为 MPZ 浓度，x 轴为吸光度。通过校准品点绘制宜拟合直线，可通过回归分析确定。还建议使用一些 plot 软件。如果样本已被稀释，则从校准曲线中读取的浓度必须乘以稀释因子。
性能
检测范围
0.156–10 ng/mL。
用于 ELISA 的校准曲线浓度为 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL。
灵敏度
人 MPZ 的小可检测剂量通常低于 0.052 ng/mL。本试验的灵敏度或检测下限 (LLD) 定义为可与零区分的低蛋白浓度。测定零校准品 20 次重复测定的平均 O.D. 值加上 3 个标准差。
特异性
该方法检测人 MPZ 具有较高的灵敏度和*的特异性。未观察到人 MPZ 和类似物之间存在显著的交叉反应性或干扰。
注：受当前技能和知识的限制，我们不可能完成人 MPZ 与所有类似物的交叉反应检测，因此交叉反应可能仍然存在。
分析方法总结
1. 准备所有试剂、样本和校准品；
2. 向每个孔中加入 100µL 校准品或样本。在 37 ℃ 下孵育 2 小时；
3. 加入 100µL 制备好的检测试剂 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小时；
4. 抽吸并清洗 3 次；
5. 加入 100µL 制备好的检测试剂 B。在 37 ℃ 下孵育 30 min；
6. 抽吸并清洗 5 次；
7. 加入 90µL 底物溶液。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min；
8. 加入 50µL 终止液。立即在 450 nm 处读数。
重要说明
1. 终的实验结果将与终端用户的操作技能和实验环境密切相关。请确保有足够的样本可用。
- 不同批次的试剂盒在检测范围、灵敏度和显色时间上可能略有不同。请严格按照试剂盒随附说明书进行实验，同时使用我们网站的电子版（www.k-assay.com）仅供参考。
3. 请勿将一批试剂盒中的试剂混合或替换为另一批试剂盒。仅使用制造商提供的试剂。
4. 储存和孵育期间，所有试剂均应避免强光照射。所有试剂瓶盖应盖紧，防止微生物蒸发和污染。
- 一次开板时孔内可能有一些雾状物质。不会对终试验结果产生任何影响。在需要之前，请勿从储存袋中取出微量滴定板。
- 试剂制备和上样过程中的错误操作，以及酶标仪参数设置不正确可能导致结果不正确。在 450±10 nm 波长下，带宽为 10 nm 或更低、光密度范围为 0-3 O.D. 或更高的酶标仪可用于吸光度测量。实验前请仔细阅读说明书并调整仪器。
- 即使是同一个操作员也可能在两个独立的实验中得到不同的结果。为了获得更好的重现性结果，应控制试验中每个步骤的操作。此外，建议在各批次测定前进行初步实验。
- 每个试剂盒均通过了严格的质量控制检测。然而，由于一些非预期的运输条件或不同的实验室设备，终端用户的结果可能与我们的内部数据不一致。不同批次试剂盒之间的批内方差也可能由上述因素引起。
- 来自不同生产商的相同产品的试剂盒可能会产生不同的结果，因为我们尚未将我们的产品与其他生产商进行比较。
- 建议与该试剂盒一起使用的终止液为酸性溶液。使用本材料时，请佩戴眼睛、手、面部和衣物。
仅供研究使用。不得用于诊断程序。