Hieff NGS^® OnePot cDNA & gDNA Library Prep Kit是针对Illumina^®或者MGI^®测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容cfDNA样本的建库。该试剂盒使用了最新优化的连接酶，改善了接头连接时的片段自连现象，同时替换了新型高保真酶，进一步提升了扩增的均一性和保真性。

Ø 适用500 pg-1 μg的基因组DNA、全长cDNA（衔接Hieff NGS^® ds-cDNA Synthesis Kit全长cDNA合成试剂盒（Yeasen Cat#13488））等样本；
Ø 高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段无偏好性；
Ø 片段化、末端修复/加A一步完成；
Ø 强扩增效率的高保真酶，显著提高文库质量及产量；
Ø 适用于cfDNA样本；
Ø 严格的批次性能与稳定性质控；

 

产品组分

组分编号             组分名称			13502ES24	13502ES96
13502-A		Smearase Buffer	240 μL	960 μL
13502-B		DNA Extra-working Buffer	240 μL	960 μL
13502-C		Smearase Enzyme Mix	120 μL	480 μL
13502-D		Ligation Enhancer	720 μL	2×1440 μL
13502-E		Novel T4 DNA Ligase	120 μL	480 μL
13502-F		2× Ultima HF Amplification Mix	600 μL	2×1200 μL

 

运输与保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

 

注意事项
一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
7. 本产品仅作科研用途！

 

二、关于接头连接（Adapter Ligation）

Illumina接头：

1. 本公司可提供短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

目前有双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 （Cat#12412~Cat#12413）。

2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的DNA或者RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM，接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA/DNA量与接头使用浓度推荐表

Input Total RNA（参照Cat#13488 RNA投入量）	Adapter stock concentration	Input Total DNA	Adapter stock concentration
≥10 ng	15 μM	1μg~200 ng	15 μM
<10 ng	3 μM	100 ng	10 μM
		50 ng	5 μM
		10 ng	3 μM
		5 ng	1μM
		≤1ng	0.5μM

 

三、关于文库扩增（Library Amplification）

文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1mg文库的推荐循环数。

表 2 Input Total RNA或者DNA量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles	Input Total DNA	Number of cycles
<1 ng	10~12	<1 ng	14~16
1ng	9~10	1 ng	13~14
10 ng	6~7	5 ng	10~11
50ng	4~5	10 ng	9~10
100~1000 ng	4	50 ng	7~8
		100 ng	6~7
		200 ng	5~6

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

 

四、DNA磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

 

五、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

六、自备材料（Other Material）

1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效产品。

2. Adapters：含Index的长接头（Yeasen Cat#12615~12618）或者无Index的短接头试剂盒（Yeasen Cat#12611~12614）。

3. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

4. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

建库流程图

   

 图1 DNA建库操作流程

 

使用方法

Step 1 cDNA & gDNA片段化/末端修复/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

该步骤将cDNA & gDNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表3中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表3反应体系。

表3  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

名称	体积（μL）	名称	体积（μL）
2nd Strand cDNA	35	gDNA	35
Smearase Buffer	10	Smearase Buffer	10
Smearase Enzyme Mix	5	Smearase Enzyme Mix	5
RNase-free H2O	10	DNA Extra-working Buffer	10
Total	60	Total	60

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表4所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表4  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

温度	时间
热盖105°C	on
4°C	1 min
30 °C	5–20 min**
72 °C	20 min
4°C	Hold

【注】：*DNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4°C，待模块温度降至4°C时，将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表5。

表5  片段化时间选择表

插入片段主峰大小	片段化时间
300~500 bp	5 min
250 bp	10 min
200 bp	15 min
150 bp	20~30 min

 图2  不同片段化条件下的文库峰形参考

 

Step 2 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina^®或者MGI^®接头。

1. 参考注意事项二中的表1，根据Input DNA，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表6中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于Step 1步骤结束后的PCR管中继续配制表6所示反应体系。

表6 Adapter Ligation体系

名称	体积（μL）
dA-tailed DNA	60
Ligation Enhancer	30*
Novel T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**
Total	100

【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
**本公司Illumina接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表7所示反应程序，进行接头连接反应：

表7 Adapter Ligation反应程序

温度	时间
热盖	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

 

Step 3连接产物纯化（Post Ligation Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.45×，Beads:DNA=0.45:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，用10 μL移液器吸干净残留液体，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。

 

Step 4 文库扩增（Library Amplification）

该步骤将对纯化后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表8中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表8所示反应体系。
表8 短接头连接产物PCR反应体系（Illumina扩增体系）

组分名称	体积（μL）
2× Ultima HF Amplification Mix	25
Universal Primer/ i5 Primer*	2.5
Index Primer/ i7 Primer*	2.5
Adapter Ligated DNA	20
Total	50

【注】：*使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂（Cat#12412~Cat#12413）中配备的Index primer进行扩增。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表9示反应程序，进行PCR扩增。

表9  PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	参照注意事项三，文库扩增
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	1 min	1
4°C	Hold	–

 

Step 5 扩增产物磁珠纯化（Post Amplification Clean Up）

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，用10 μL移液器吸干净残留液体，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入32 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取30 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

 

Step 6 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

 

HB220810