发光法支原体检测试剂盒说明书

产品详情

产品描述

《发光法支原体检测试剂盒》通过检测支原体含有的特异性 ATP 合成相关酶的活性以达到检测体外培养的哺乳动物细胞是否被支原体污染的目的。

在支原体裂解后，该支原体特异性的酶，在底物存在下，具有将 ADP 转化成 ATP 的功能。由于荧光素酶（Luciferase）催化底物荧光素（Luciferin）产生光的反应需要 ATP 的参与，支原体特异性酶催化产生的 ATP 含量，可以通过该反应转化成生物发光（Bioluminescence）信号，该信号可以使用专门的发光检测仪（Luminometer）或具有发光检测功能的多功能酶标仪进行检测，发光的强度与 ATP 的含量成正比。

具体的反应如下：通过比较细胞培养上清和未用于细胞培养而成分相同的培养液二者的支原体特异性酶的含量，即可知道培养的细胞是否被支原体污染。

产品特点

《发光法支原体检测试剂盒》具有如下显著的优点：

1. 检测时间短。整个检测过程只需 30 分钟左右。

2. 《发光法支原体检测试剂盒》检测的是活支原体，只有样品中存在活的支原体，才会生产阳性结果，可以区分支原体的死活。而《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》都是检测支原体的DNA，不论支原体的死活，样品中只要有支原体DNA的存在，就会生产阳性结果，所以无法区分支原体的死活。细胞培养中，最关心的是细胞培养液上清或者血清、胰酶等成分中，是否有活的支原体。而如果仅有死的支原体或者一些残存的支原体 DNA，是无关紧要的。

3. 不存在假阳性。由于《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》都需要对支原体 DNA 进行大量的扩增，检测过程中，只要有微量的支原体 DNA 或者扩增产物的污染，就会出现假阳性。而《发光法支原体检测试剂盒》只检测活的支原体，不存在扩增产物污染样品的问题。

4. 不存在因反应被抑制导致的假阴性。由于细胞培养数天后，培养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物， 所以使用《PCR 法支原体检测试剂盒》经常会出现假阴性的问题。该问题在《发光法支原体检测试剂盒》不存在。

5. 《发光法支原体检测试剂盒》对支原体的识别率高：由于本试剂盒依赖的支原体特异性酶普遍存在，其具有广谱的识别能力。

产品组分

（1） 支原体检测溶液：5.5 mL

（2） 试剂 A(已冻干)：2.5 mL（50 次检测）

（3） 试剂 B(已冻干): 2.5 mL（50 次检测）

使用方法

使用方法

1. 检测试剂的分装和保存

收到的产品为冻干品，溶解前，请放-80 ℃冰箱低温保存。第一次使用前，在冰上操作，分别用 2.5 mL 支原体检测溶液溶解试剂 A 和试剂 B（注意：因为试剂 A 和试剂 B 的离心管容量不足 2.5 mL，可以分别先用 1 mL 支原体检测溶液将冻干的试剂 A 和试剂 B 溶解后，转移到一个 5 mL 或 10 mL 的离心管中，再各补加 1.5 mL 支原体检测溶液）, 按每管 50 μL 分别分装到 50 个 1.5 mL 离心管中，立即放-80 ℃冰箱低温保存。

2. 阴性对照的设置

本试剂盒每次检测都必须设置阴性对照。阴性对照必须使用配制完后放于 4℃冰箱，未用于细胞培养但成分相同的培养液，包括其中的血清、抗生素等含量也必须相同。特别是其中的血清含量和批次，对发光的本底值影响很大，作为阴性对照的培养液，其中添加的血清，必须与用于细胞培养的血清批次相同且含量相同。例如：如果用于细胞培养的培养液为含有 10%的胎牛血清的高糖 DMEM，那么阴性对照也应该使用含有相同批次的 10%的胎牛血清的高糖 DMEM。如果用于细胞培养的培养液为无血清培养液，那么阴性对照也应该使用无

血清但成分相同的培养液。

上述阴性对照的选取是按照严格的方式进行的。如果确实没有成分相同的培养液，也可以使用成分接近的培养液作为阴性对照。如果有些样品实在没有合适的阴性对照或者不知道样品原来的培养基组成，可以尝试使用含10%血清的 DMEM 培养基作为阴性对照。

3. 阳性对照的设置

如果您实验室拥有经其他支原体检测方法（比如本公司的《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《PCR 法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》等）检测为阳性的细胞系，其培养 3 天后的上清即可以直接按照后文的样品准备方法，自己制备阳性对照。

如果您没有上述阳性样品，那么阳性对照也可以从我们公司单独购买（货号：LPC10）。如果第一次使用《发光法支原体检测试剂盒》，建议购买一支本公司的《发光法支原体检测试剂盒阳性对照》。

4. 待测样品的准备

为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品最好来源于至少培养 2-3 天且汇合度在 70-90% 左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，至少让细胞生长 2-3 天再取培养液进行检测。具体操作如下（请严格按照相应的体积进行操作）：

（1）根据浓缩倍数，可以取 180-1500 μL 上述待测样品到 1.5 mL 离心管内，在普通台式离心机上 1000 rpm (大约 150 g)低速离心 5 minutes，将离心后的上清转移到另一个离心管内（注意：转移离心上清时，请保留底部 60 μL 左右的液体，以防止将底部细胞沉淀吸走！），丢弃含细胞沉淀的原有离心管。

（2）将含有上清的新的 1.5 mL 离心管，在普通台式离心机上 16000 g （大约 13000 rpm）高速离心 5 分钟， 沿离心管内壁离心时的内侧面将离心后的上清小心缓慢全部吸走并丢弃（注意：勿让吸头碰到离心管内壁的底部 外侧，因为底部外侧可能含有支原体的沉淀！）。往离心管内，加入 120 μL 作为阴性对照的培养液。

（3）将上述经过离心清洗一次的样品， 再次在普通台式离心机上 16000 g （大约 13000 rpm）高速离心 5 分钟【离心时注意保持离心管放置的方向与上述步骤（2）相同】，同样小心吸走 115 μL 离心后的上清并丢弃（注意：同样勿让吸头碰到离心管内壁的底部外侧。留下大约 5 μL 培养液的目的也是为了防止吸头碰到离心管底部外侧而将可能含有支原体的沉淀吸走）。往离心管内，加入 115 μL 作为阴性对照的培养液（此时，总体积仍然为 120 μL）。

（4）将上述经过离心清洗两次的样品，用移液枪上下吹吸 10-20 次，将可能含有支原体的沉淀吹打均匀。至此，该样品方可用于后续的支原体检测（够两次检测使用）。

（5）吸取 50 μL 阴性对照、阳性对照或者已经经过低速离心去除细胞和经过高速离心替换成阴性对照的培养液的待测样品，放入黑色（优先选择）或者白色不透明的 96 孔板内，加入 50 μL 冰上放置的试剂 A，室温反应 15 分钟。

（6）室温反应 15 分钟后，加入 50 μL 冰上放置的试剂 B，无需等待，立即在具有发光检测功能的多功能酶标仪或者单独的发光检测仪（Luminometer）上，以仪器默认的萤火虫荧光素酶（Luciferase）的发光检测参数进行发光值的检测，5 分钟内，连续测 5 次阴性对照和待测样品的发光值，计算各自的平均值。

注意事项

1、 本试剂盒只在 96 孔板进行过测试。因为发光值会随时间略有变化，如果使用单管的发光检测仪，尽量保证阴性对照和待测样品加入试剂 A 后的反应时间和加入试剂 B 后到发光值检测的反应时间相同。

2、 问：如果配制完后放于 4℃冰箱未用于细胞培养且成分相同的培养液本身有支原体污染（比如加入的血清本身含支原体），是否仍然可以用作阴性对照？

答：可以。因为：即使作为阴性对照的培养液本身有支原体污染，其中的含量也是极其微量的。而待测样品是经过培养 3 天以上的，其支原体在这 3 天培养过程中，会大量繁殖，用《发光法支原体检测试剂盒》检测的发光值，肯定比阴性对照的发光值高得多。