genebridges K006说明书

Quick & Easy E.coli Gene Deletion Kit

快速简便的大肠杆菌基因删除试剂盒

用于快速敲除或修饰大肠杆菌染色体上的基因。

特征

• Red / ET的忠实重组
• 快速准确
• 可能有多个淘汰赛
• 方便地去除重组质粒

应用领域

• 该试剂盒旨在在不到一周的时间内敲除或改变大肠杆菌染色体上的基因

大肠杆菌染色体上基因的靶向破坏

1.转化用表达质粒pRedET转化将被修饰
的大肠杆菌菌株。

2. Red / ET重组
Red / ET表达是通过添加L-阿拉伯糖和温度变化来诱导的。含有50 bp同源臂的FRT-PGK-gb2-neo-FRT盒被转化。Red / ET介导的重组通过插入盒带破坏了靶基因座。

3.可选：去除选择标记
Flp介导的切除，仅留下一个FRT部位。（另请参见我们的FRT选择盒和Flp表达质粒和菌株）。

描述

Red / ET重组使碱基对可以准确，特异性和忠实的方式交换遗传信息。试剂盒随附有FRT侧翼的卡那霉素抗性标记盒，可用于替换大肠杆菌染色体上的基因。Red / ET重组可替代大肠杆菌染色体上长达30kb的片段。如果需要，使用FRT侧翼抗性盒替代靶基因可以随后通过FLP重组酶步骤去除选择标记。FLP表达质粒可以从Gene Bridges购买。通过重复插入试剂盒附带的功能盒或与Gene Bridges提供的其他功能盒组合，可以产生多个基因敲除。重组过程由于pRedET表达质粒的优化设计而受到严格控制。重组蛋白的基因在诱导型启动子的控制下，质粒带有温度敏感的复制起点，可在重组后方便地去除质粒。

内容

• 两个Red / ET重组蛋白表达质粒pRedET（tet）和pRedET（amp）。通过用这些质粒转化，可以使任何大肠杆菌菌株变成Red / ET熟练的。
• FRT位于卡那霉素抗性模板的侧面（FRT-PGK-gb2-neo-FRT），可用于您自己的实验。
• 替代大肠杆菌染色体上甘露糖转运蛋白（manX）基因的阳性对照。
• 详细的协议，质粒，图谱和序列的描述。

顺序

FRT-PGK-gb2-neo-FRT

AATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGG AACTTC ATT CTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGC GCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCA CACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTT CGCGCCACCTTCCACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTC GCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGA TGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATA GCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGG GGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAG GCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTC CTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGC ATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGGATCG GCCATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGC TATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACGATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTT CCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGT GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGG GCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCT GCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCC GAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGG CTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCG GATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC GCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATC TCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCG CTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGAC ATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACC GCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTA TCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAATAAAGACCGA CCAAGCGACGTCTGA GAGCTCCCTGGCGAATTCGGTACCAATAAAAGAGCTTTAT TTTCATGATCTGTGTGTTGGTTTTTGTGTGCGGCGCG GAAGTTCCTATTCTCTAG AAAGTATAGGAACTTC CTCGAGCCCTATAGTGAGTCGTATTA

genebridges K001说明书

Quick & Easy BAC Modification Kit

快速简便的BAC修改套件

• ID: K001

特征

• 快速可靠地克隆大DNA分子

• 在选择的位置进行的DNA修饰

• 独立于限制网站

• 没有尺寸限制

应用

• 简单的BAC修饰，如插入选择标记，删除带有选择标记基因的片段，插入功能片段和选择标记基因

• 该试剂盒也可用于细菌染色体修饰

描述

该试剂盒旨在通过革命性的Red / ET重组技术对BAC进行修饰 – 这是一种强大的工具，可在2周内将修饰（如插入和缺失）引入任何类型的BAC。

红/ ET重组使用体内重组和校对活动来小化构建体中不需要的突变。套件中包含了修改BAC所需的所有必要内容以及执行控制实验所需的所有材料，旨在让您熟悉这种新技术。另外，转化任何大肠杆菌的载体提供了用于应用Red / ET重组的感受态菌株的菌株。pSC101-BAD-gbaAtet带有四环素抗性盒。该盒含有温度敏感的复制起点（ori），只能在30°C繁殖 – 在37°C时质粒会丢失。这允许在不再需要质粒时简单地去除质粒。为了引入突变（即选择盒，如该试剂盒中包含的新霉素抗性盒），首先必须将同源序列引入选择盒。这可以通过简单的PCR反应来完成。这些短的同源序列（每个50nt）可以根据您的实验需要自由选择。只需选择要修饰的位置，并使用Red / ET重组技术将选择盒直接插入所需的核苷酸。然后需要用诱导的Red / ET重组系统在细菌中电穿孔PCR产物。在成功进行Red / ET重组后，可以使用常规DNA微量制备方法回收修饰的DNA。

内容

• pSC101-BAD-gbaA（tet）是基于Red / ET表达质粒的pSC101 ori（温度敏感起源）的衍生物

• 携带pSC101-BAD-gbaA（tet）的BAC宿主

• 用于修饰150kb BAC的阳性对照实验（携带pSC101-BAD-gbaA的宿主中的BAC克隆，用于在BAC骨架中缺失的新PCR产物，在宿主中作为阳性重组体的BAC-neo克隆）

• 方案，质粒描述，寡核苷酸图谱和序列

Sequences

Tn5-kan^R/neo^R selection cassette

Tn5-promoter  kan^R/neo^R

TGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGA AGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAG GGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAA GATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATG ACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGC GCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAA CTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCG CAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGA AGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCC ATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCAT TCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGG TCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAA CTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCC ATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATT CATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCT ACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGC TTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGA

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