一步法恒温支原体检测试剂盒(溶液型)说明书

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产品描述

 哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至错误。从2013年开始，《Nature》期刊已要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

        培养法是相对可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外，通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。

        有的实验室使用荧光染色法检测支原体，但是该方法灵敏度太低，而且严重依赖实验人员的经验，实验的稳定性极差。此外，当该方法检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。

        培养法和荧光染色法虽然是我国药典收录的支原体检测方法，但是因为其各自都有明显的缺点，不适合作为支原体快速检测的方法。

        本公司目前已经开发出四种不同原理的快速支原体检测试剂盒，分别是：《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》，其各自都有自己的优缺点。

        《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用恒温基因扩增技术，有明显的优点：（1）整个检测过程只需1小时，大大缩短了检测时间；（2）未发现细胞培养液中的PCR抑制剂会抑制恒温基因扩增，所以一般无需进行样品的前处理；（3）恒温基因扩增的灵敏度良好，一般比30个循环普通PCR法高；（4）恒温基因扩增的产物无需电泳，可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果；（5）无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪等仪器，整个检测过程只需一个水浴锅。

        经测试，本试剂盒至少可以检测以下13种支原体：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M. pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis（注：M.为Mycoplasma的缩写；A.为Acholeplasma的缩写）。其中，前8种为是最常见的污染细胞的支原体种类，约占污染细胞的支原体的98%左右。以上13种约占污染细胞的支原体种类的99%左右。

        《一步法恒温支原体检测试剂盒》的检测灵敏度：经测试，在每个反应管的DNA加入量为2 μL的情况下，《一步恒温法支原体检测试剂盒》的最高检测灵敏度（即检测下限）大约在20-400个copies，即10-200 copies/μL。可以通过离心浓缩、提取支原体基因组DNA等措施，其检测灵敏度可以在此基础上继续提高10-100倍。

        由于任何一种快速支原体检测方法都无法保证检测结果100%正确，如果您想得到100%正确的支原体检测结果（比如，开展细胞治疗的客户，进行干细胞培养的客户，生产血清、胰酶、培养液的客户，出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等），任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测，将会得到比较满意的结果。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致，正确率几乎就是100%。

产品组分

（1）溶液1：1150 μL （50次检测）；

（2）溶液2：55 μL；

（3）溶液3：指示剂，38 μL

（4）阳性支原体DNA：50 μL；     

（5）矿物油：1500 μL。

使用方法

使用方法

1. 待测样品的准备：

     为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品需要取自换液后培养2-3天且汇合度在90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，让细胞生长2-3天再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理：

方法一：直接检测（该方法无法去除可能的干扰物，显色被干扰的可能性相对较大）：

（1）取150 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上1000 rpm (大约150 g)低速离心5 minutes，取离心后的上清100 μL用于支原体检测，丢弃下层剩余的50 μL（含细胞沉淀）。

（2）已经离心去除细胞的待测样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定），具体如下：95 ℃加热处理5 minutes（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。 

方法二：简单离心清洗（推荐方法。该方法不仅可以浓缩支原体从而提高检测的相对灵敏度，还可以去除绝大部分可能的干扰物，显色被干扰的可能性极小。如果该简单一步离心清洗的方法仍然无法去除干扰物，可以使用后文注意事项部分的三步离心清洗的方法。）：

（1）根据浓缩倍数，可以取100 – 1500 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上1000 rpm (大约150 g)低速离心5 minutes，将离心后的上清转移到另一个离心管内，丢弃细胞沉淀。

（2）将上清继续13000 rpm（约16000 g）高速离心5 minutes，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液体），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（样品可以长期保存。推荐）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬沉淀（沉淀中含有支原体），吹吸均匀【如果最初使用了1500 μL的样品而最后用20 μL重悬，则支原体浓度大约提高了75倍，相对灵敏度也提高了75倍】。

（3）该重悬后的样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95 ℃加热处理5 minutes（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。

实验案例分析

  我们选取了比较有代表性的4种支原体（分别是：M. hyorhinis，M. fermentans A. laidlawii和M. pirum），使用含相应支原体基因片段的质粒载体，经DNA定量后，计算出相应的分子数。

        质粒经4倍系列稀释【从4^(0)到4^(-8)】，进行相应的恒温扩增（每个反应管的DNA加入量为2μL，每个稀释度做2个重复），并对恒温扩增产物进行拍照。恒温扩增反应的结果下图所示：

注意事项

1. 请确保样品加入后，反应之前：阴性、阳性和所有待测样品的颜色基本一致。如果个别样品，一旦加入，反应管的颜色就与阴性、阳性明显不同，说明其中含有可干扰本系统正常指示效果的物质，必须先去除。此现象曾经在检测CHO无血清培养基和一些血液制品（比如：白蛋白溶液、血浆原液、血清原液等）上发生过。常见的DMEM、MEM、F12、1640等培养基（可以含10%血清）一般不会发生该现象。去除方法：（1）离心清洗：取1 mL细胞上清或待测样品（比如：白蛋白溶液、血浆原液、血清原液），先13000 rpm离心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次离心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次离心，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液体），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（样品可以长期保存。推荐）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬沉淀，吹吸均匀。该重悬后的样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95 ℃加热处理5 minutes（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。由于离心清洗可能导致支原体部分丢失，如果样品支原体含量很低，可能导致漏检。（2）使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》提取支原体DNA后进行检测。通过DNA提取，即可以将所有可能的干扰物质全部去除，又可以将支原体DNA浓缩10-100倍。

2. 由于恒温扩增所用的各种酶强烈依赖溶液中的二价离子，待测样品的EDTA等金属离子螯合剂只能微量存在。如果打算用试剂盒提取支原体DNA（推荐使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》），请用去离子水或者不含EDTA的5 mM Tris.HCl（pH 8.0-8.8）的缓冲液洗脱和溶解DNA。

3. 防DNA污染注意事项：

（1）恒温反应体系配制的房间（本试剂盒请在有窗户、通风良好的普通房间操作。请勿在密闭的细胞培养间进行该步骤的操作，因为细胞培养间支原体污染概率很高），与用于样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间一定要分开。

（2）强烈建议使用滤芯吸头吸取相关溶液和阳性支原体等。如果没有滤芯吸头，至少应该使用新开封的吸头。

（3）必须确保使用的移液枪本身没有残留的支原体。因此，最好使用全新购买的移液枪。如果没有新购买的移液枪，至少应该使用以前没有进行过细胞培养的移液枪。因为进行过细胞培养的移液枪极有可能被含支原体的培养液污染（如细胞培养时，不小心将含支原体污染的培养液吸入移液枪的枪体内）。移液枪中吸附的支原体有可能造成不必要的假阳性。

（4）样品前处理的各类吸头、离心管，以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头，务必小心处理，请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内，全部样品吸取完后，盖上瓶盖，以防止阳性DNA的挥发，造成环境的污染，进而造成假阳性。

（5）整个操作过程，最好不要说话，因为人的口腔和唾液都是带支原体的。

（6）反应后，请勿打开反应管的盖子，否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后，将其用自封袋密闭，扔到另外一个房间的垃圾桶内。

4. 本试剂盒的检测准确率：（1）由于本试剂盒能识别的支原体大概只占了污染细胞的支原体的99%左右，还有1%左右的污染细胞的支原体有可能不认识，这可能会导致1%左右的假阴性（漏检）。（2）由于人体的口腔、皮肤和尿道都是含有支原体的，而且常用的肿瘤细胞系支原体污染率非常高，一般在15-90%之间，导致实验室环境甚至移液枪也经常含有支原体，这可能导致出现极个别的假阳性（多检，正常这种概率应该低于1%）。总体来说，单独使用本试剂盒有可能出现1-2%左右的错误率（注意：细胞培养中支原体出现的概率是来自文献数据，是大量体外细胞培养支原体污染调查的结果。如果你们实验室细胞污染的恰巧是出现概率比较低而本试剂盒又不认识的支原体，漏检的概率会大幅度上升。因此：对所有重要的样品（比如，可能用于人体的细胞），不能只依靠本试剂盒就下最终检测结论，必须至少同时使用另外一种支原体识别率为100%的支原体检测试剂盒【比如本公司《PCR法支原体检测试剂盒》或《探针法支原体检测试剂盒》】进行检测，互相验证！）。为了提高检测的准确率，建议客户采取以下两种措施：第一，对所有本试剂盒检测出的阳性样品，利用本试剂盒或者其他不同原理的支原体检测试剂盒进行复检（复检可以基本排除因环境污染导致的假阳性），或者检测时所有样品直接使用两个反应管同时检测检测，只有同一个样品两个反应管的检测结果都为阳性时，才能判断为真正的阳性样品。第二，对所有重要的样品（比如，可能用于人体的细胞），必须至少同时使用两种（甚至三种）不同原理的支原体检测试剂盒（其中一种方法推荐使用支原体识别率为100%的《PCR法支原体检测试剂盒》或《探针法支原体检测试剂盒》）进行检测，互相验证。

5. 如发现细胞被支原体污染，本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂，以及水浴专用杀菌剂和环境专用杀菌剂。

6. 支原体检测样品可以分成两类：第一类，用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达107-9/mL，可以直接检测。第二类，低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩或者使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》将支原体DNA浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7天后，再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要3-7天，但是可靠性高。

7. 如何提高本试剂盒检测灵敏度：如果预期待测样品支原体含量较少（比如，低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取以下几种措施：（1）通过使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》，将支原体DNA浓缩提取后再进行检测（提取过程还可以把所有可能的PCR抑制剂全部去除），大约可以将检测灵敏度提高10-100倍。（2）对支原体进行离心浓缩：取1 mL细胞上清，先13000 rpm（约16000 g）离心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 minutes，简单离心后（1000 g，5 seconds），取上清进行检测。该离心浓缩过程大约可以将检测灵敏度提高20倍。

运输及保存方法

        该产品随冰袋运输，收到产品后请立即放-20 ℃冰箱保存，该条件下，至少3年内仍然有活性。

产品用途

   《一步恒温法支原体检测试剂盒》（One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit）主要用于检测细胞培养液或别的液体样品中是否含有支原体。本产品仅供科研使用。