KlenTaq-S 测序酶


KlenTaq-S 测序酶

简要描述:KlenTaq-S 测序酶是Taq DNA 聚合酶的改造版,为 Taq DNA 聚合酶的大片段,并做了基因突变。本酶具有 5’→3’聚合酶活性,无5’→3’外切酶活性和 3’→5’外切酶活性。

详细介绍

产品咨询

本公司 KlenTaq-S 测序酶是重组表达,并经多步纯化制备的重组蛋白。

活性定义活性单位指在 72℃下, 1×AM PCR Buffer 130 min 内将 10 nmole dNTP 掺入酸不溶性物质所需的酶量。特点

1.尤其适合 ddNTP 等修饰核苷酸的掺入反应

2.相比全长 Taq DNA 聚合酶,本酶比活性有所降低

适用范围

ddNTP 终止法DNA 测序(一代测序

焦磷酸解反应延伸法 SNP 分析

质量控制

经过严格的质控检测,确保该产品具有最高的活性和纯度。

酶贮存缓冲液

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P40, 0.5%Tween20, and 50% glycerol.

应用举例

以下反应举例为 50 μl 标准 PCR 体系,仅供参考。实际 PCR 条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化,确定最佳反应条件。

1) 按下表配制反应体系

组份 

体积/μl

终浓度 

10×AM PCR Buffer 1

5

dNTPs2.0 mM

5

0.2 mM

引物 F10 μM

1.5

0.3 μM

引物R10 μM

1.5

0.3 μM

Template

Varable*

/

KlenTaq-S测序酶(5U/μl

0.5

2.5U

ddH2O

Varable

/

总体积

50

/

*模板DNA用量参数(50 μl反应体系):

人基因组DNA100-1000 ng ; 微生物基因组DNA 10-100ng;PCR产物 1 ng-10 ng Plasmid DNA 5-30 ng ; cDNA from RT reaction 1-5 μl 。

 

2) 按如下条件进行反应,

95

2-5 min

95

15 sec

 

25-35 Cycles

55~72

20 sec

72

1kb/min

72

5 min

3) 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物,或按实验目的进行后续操作。

注意事项1.PCR 条件和野生型 Taq DNA 聚合酶类似,对特定 DNA 的测序反应可能需要优化。2.本酶扩增能力较野生型 Taq DNA 聚合酶有所降低,PCR 产量有所降低,不建议用于常规 PCR3.不可用于 Taqman 探针法 q-PCR

EdgeBio成为安捷伦新一代测序靶向序列捕获系统的认证服务提供商

订货 021-50837765

2010 年 12 月 14 日 , 北京 —— 安捷伦科技公司 ( 纽约证交所 : A ) 与 EdgeBio 公司 今日共同宣布 , EdgeBio 成为新一代测序平台安捷伦 SureSelect 靶向序列捕获系统的认证服务提供商 (CSP) 。

SureSelect 系统 自 2009 年 2 月推出以来,凭借其仅针对目标基因组区域而非整个基因组进行测序的优势 , 显著提高了新一代测序工作流程的速度和成本效益。

经过相关培训并且证明精通靶向序列捕获系统后 , EdgeBio zui终获得了 Life Technologies SOLiD 4 测序平台的 SureSelect 靶向序列捕获系统认证服务提供商资格 。

安捷伦 SureSelect 平台业务 Fred P. Ernani 博士说到 :“ 我们很高兴像 EdgeBio 这样高水平的机构致力于推动客户的新一代测序研究 , 同时为 SureSelect 在基因组学界的推广做出贡献。 ”

“ 我们很高兴能与安捷伦携手合作 , 利用安捷伦*的靶向富集系统为客户提供服务。这也进一步证实了 EdgeBio 始终致力于为客户提供zui高质量的数据。 ” EdgeBio 的 CEO Dean Gaalaas 说道。

SureSelect 系列包括针对用户的基因组区域、人类激酶组、人类 X 染色体以及人全外显子的靶向序列捕获测序产品。安捷伦 SureSelect XT 系统将测序文库制备和 gDNA 制备试剂与成熟的安捷伦 SureSelect 靶向序列捕获系统相结合 ,实现了的 分析效率和便利性。 SureSelect XT 系统可与安捷伦自动化系统相结合 , 用于大规模的高性能研究。

除了 SOLiD 平台外 , 安捷伦 SureSelect 靶向序列捕获系统还支持 Illumina 基因组分析仪和 HiSeq 平台以及 454 Life Sciences 平台。

安捷伦 SureSelect 靶向序列捕获产品系列提供业内zui全面的靶向富集产品以及针对多种不同测序方法和平台的*化方案。 SureSelect 产品可实现在单管中富集从 200 Kb 到 50 Mb 的靶向序列。

用户使用安捷伦 eArray xD 桌面设计工具 , 可以轻松设计出在单管中捕获任意感兴趣基因组区域的定制产品 , 从而提高研究效率。安捷伦还提供 eArray 在线设计工具 , 用户使用该工具可定制预定义的 SureSelect 试剂盒 , 例如 SureSelect 人全外显子系列产品。

货号 说明 包装 品牌
33617 QuickStep2 Purification Kit 36 cartridges edgebio
92159 QuickStep2 Purification Kit 108 cartridges edgebio
61303 QuickStep™2 96-Well PCR Purification Kit – Ultra plates 2 plates edgebio
97670 QuickStep™ 2 96-Well PCR Purification Kit – Ultra Plates 10 plates edgebio
72418 QuickStep2 SOPE Resin 12 ml edgebio
98780 PERFORMA® DTR Gel Filtration Cartridges 36 cartridges edgebio
42453 PERFORMA® DTR Gel Filtration Cartridges 108 cartridges edgebio
88415 PERFORMA® DTR 96-Well Standard Plate Kit (polypropylene receiver plates) 2 plates edgebio
94880 PERFORMA® DTR 96-Well Standard Plates (polypropylene receiver plates) 10 plates edgebio
25215 PERFORMA® DTR 96-Well Standard Plates (no receiver plates) 10 plates edgebio
31909 PERFORMA® DTR 96-Well Standard Plates (no receiver plates) 50 plates edgebio
63887 PERFORMA® DTR V3 96-Well Short Plate Kit 2 plates edgebio
89939 PERFORMA® DTR V3 96-Well Short Plate Kit 10 plates edgebio
47938 PERFORMA® DTR V3 96-Well Short Plates (no receiver plates) 10 plates edgebio
80808 PERFORMA® DTR V3 96-Well Short Plates (no receiver plates) 50 plates edgebio
54789 PERFORMA® DTR Ultra 96-Well Plate Kit 2 plates edgebio
55373 PERFORMA® DTR Ultra 96-Well Plate Kit 10 plates edgebio
74251 PERFORMA® DTR Ultra 96-Well Plates (no receiver plates) 10 plates edgebio
86077 PERFORMA® DTR Ultra 96-Well Plates (no receiver plates) 50 plates edgebio
52571 PERFORMA® DTR 384-Well Plates (no receiver plates) 2 plates edgebio
90636 PERFORMA® DTR 384-Well Plates (no receiver plates) 10 plates edgebio
27396 5X Sequencing Buffer* 1 ml edgebio
59710 5X Sequencing Buffer* 2 ml edgebio
78901 5X Sequencing Buffer* 10 ml edgebio
39614 ExcelaPure 96-Well UF PCR Purification Kit 1 plate edgebio
84900 ExcelaPure 96-Well UF PCR Purification Kit 10 plates edgebio
21914 Plasmid 96 MiniPrep Kit 2 plates edgebio
49181 Plasmid 96 MiniPrep Kit 10 plates edgebio
65742 Plasmid 96 MiniPrep Kit (no tips or growth blocks) 10 plates edgebio

PAP(KlenTaq-S 测序酶)说明书

PAP(KlenTaq-S 测序酶)说明书

产品详情

货号

规格

价格

78BEA10012-250U

250U

870.00

78BEA10012-1250U

1250U

3500.00

78BEA10012-5000U

5000U

11300.00

78BEA10012-12500U

12500U

26050.00

产品详情

KlenTaq-S 测序酶是Taq DNA 聚合酶的改造版,为 Taq DNA 聚合酶的大片段,并做了基因突变。本酶具有 5’→3’聚合酶活性,无5’→3’外切酶活性和 3’→5’外切酶活性。相比普通Taq DNA 聚合酶,KlenTaq-S 测序酶具有很强的 ddNTP 的渗入能力,因此其适用于终止法 DNA 测序或焦磷酸解反应 SNP 分析。

本公司 KlenTaq-S 测序酶是重组表达,并经多步纯化制备的重组蛋白。

活性定义

活性单位指在 72℃下, 1×AM PCR Buffer 130 min 内将 10 nmole dNTP 掺入酸不溶性物质所需的酶量。

特点

1.尤其适合 ddNTP 等修饰核苷酸的掺入反应

2.相比全长 Taq DNA 聚合酶,本酶比活性有所降低

适用范围

ddNTP 终止法DNA 测序(一代测序

焦磷酸解反应延伸法 SNP 分析

质量控制

经过严格的质控检测,确保该产品具有最高的活性和纯度。

酶贮存缓冲液

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P40, 0.5%Tween20, and 50% glycerol.

应用举例

以下反应举例为 50 μl 标准 PCR 体系,仅供参考。实际 PCR 条件应根据模板、引物、目的片段大小加以优化,确定最佳反应条件。

1 按下表配制反应体系

组份

体积/μl

终浓度

10×AM PCR Buffer 1

5

dNTPs2.0 mM

5

0.2 mM

引物 F10 μM

1.5

0.3 μM

引物R10 μM

1.5

0.3 μM

Template

Varable*

/

KlenTaq-S测序酶(5U/μl

0.5

2.5U

ddH2O

Varable

/

总体积

50

/

*模板DNA用量参数(50 μl反应体系):

人基因组DNA100-1000 ng ; 微生物基因组DNA 10-100ng;PCR产物 1 ng-10 ng Plasmid DNA 5-30 ng ; cDNA from RT reaction 1-5 μl 。

2 按如下条件进行反应,

95

2-5 min

95

15 sec

25-35 Cycles

55~72

20 sec

72

1kb/min

72

5 min

3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物,或按实验目的进行后续操作。

注意事项

1.PCR 条件和野生型 Taq DNA 聚合酶类似,对特定 DNA 的测序反应可能需要优化。

2.本酶扩增能力较野生型 Taq DNA 聚合酶有所降低,PCR 产量有所降低,不建议用于常规 PCR

3.不可用于 Taqman 探针法 q-PCR

浓度

5U/uL

运输与保存

-20℃可保存 2 年,避免反复冻融

hssnet定制DNA测序服务

hssnet定制DNA测序服务

HSS以极短的周转时间和有竞争力的价格提供序列数据。测序基于高质量的寡聚合成技术。
HSS努力成为每个客户自己的测序部门。

 

Primer Walking

  长序列是通过Primer Walking方法和您提供的DNA样品确定的。
通过使用根据先前测序结果设计和合成的引物进行连续分析,可以获得高质量的数据。

 

 服务说明
服务说明
  对您提供的DNA样品进行了几次测序分析。
从测序结果中设计出新的引物,然后合成这些引物用于其他测序反应,因此通过重复此过程即可确定长序列。
有两种方法可供选择:单链测序(SSS)和双链测序(DSS),具体取决于应用程序。
  该服务包括;

-QC-
引物设计和合成
-测序反应
-测序仪运行
-数据检查
-组装数据生成

  试剂: BigDye*v3.1   BigDye Terminator v3.1
  设备: 3730xl DNA分析仪
    3130xl基因分析仪
 
 
  *标准序列数据在一个反应​​中包含约500个碱基。
   可以执行重复分析以涵盖需要分析的所有基础。
   例如)用于底漆行走(SSS)约。3.0kb序列;
   通常,大约。将进行6个反应。(3,000bp / 500bp每个反应= 6个反应。)

可交付成果
  该报告将通过网站和CD-R发送。

可交付成果
  -HSS合成引物
  -CD-R

中的CD-R
  数据-基本序列数据(文本文件)
  -原始数据(AB1文件)
  -组合数据
  -引物信息

*原始数据(Ab1文件)的免费查看器通知一阶。
*每个测序反应的进度报告可以根据要求通过电子邮件发送。
*请注意,网站上上传的数据将在大约之后删除。3个月。

 价格和国内订单交货时间
价格和国内订单交货时间
  价格和交货时间在不断变化,具体取决于所需的长度。以下价格包括引物设计和合成,测序分析和组装。
 
(不含税)
待分析长度 单股 交货时间 双链 交货时间
Uo至1.0kbp 22,000日圆 约 2周 44,000日圆 约 2周
Uo至1.5kbp 30,500日圆 约 3周 61,000日圆 约3周
Uo到2.0kbp 39,000日圆 78,000日圆
Uo到2.5kbp 56,000日圆 约 1个月 112,000日圆 约 1.5个月
Uo到3.0kbp 64,500日圆 129,000日圆
Uo至3.5kbp 73,000日圆 146,000日圆
Uo至4.0kbp 81,500日圆 163,000日圆
Uo到5.0kbp 107,000日圆 约 1.5-2
个月
214,000日圆 约 
– 2.5个月
Uo至6.0kbp 124,000日圆 248,000日圆
Uo到7.0kbp 149,500日圆 299,000日圆
Uo到8.0kbp 166,500日圆 333,000日圆
Uo到9.0kbp 192,000日圆 384,000日圆
Uo至10.0kbp 234,500日圆 469,000日圆
  *样品数量和分析条件可能会影响交货。
   订购时请要求实际交付。
*对于已知序列的分析,可能会缩短交货时间。请向我们询问详细信息。

 

要求
 
DNA样本 质粒:浓缩; m / z。100-300ng / uL或更多,数量;根据需要* 1
PCR产物:浓缩;20ng / uL以上,数量;根据需要* 1,2
底漆
(定制底漆)
对于任何类型的样品:浓度;10uM,数量;一次分析使用10uL或更多的Primer。
对于通用底漆,
电泳图像 请发送在同一凝胶上显示标记物和样品结果的图像及其数量说明。
  * 1所需的DNA样品量取决于分析长度。将1-5uL样品
    用于一个反应,该反应可生成约500个碱基的数据。请发送
    尽可能多样品。

* 2对于PCR产物,请确保在PCR反应后进行纯化。有关我们的样品
    纯化服务,请单击此处以获取详细信息。

      有关详细信息,请参见以下链接。
    -如需样品制备,请单击此处
    -有关电泳照片,请单击此处
    -有关通用底漆的列表,请单击此处
  * 3建议使用琼脂糖电泳来测量样品浓度。
    随订单一金畔送的电泳图像将用作选择反应条件的参考。
    请提供标记名称,在
    电泳图像上施加标记和样品的量
  * 4请从自定义测序服务订购单上的Primer Walking计划中选择(SSS)或(DSS)。

Hifair® Smearase 高通量测序酶切试剂 片段化酶

Hifair® Smearase 高通量测序酶切试剂 片段化酶

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Hieff ® Smearase 是针对高通量测序平台设计的新一代酶切试剂。本品采用高质量的片段化酶,酶切效果稳定,偏好性 低,可有效降低片段化的时间和成本,摆脱了繁琐的超声步骤,让片段化过程变得更加简单高效。

产品组分

组分编号

组分名称

8 T

24 T

96 T

12907

Hieff ® Smearase

80 μL

240 μL

960 μL

 

运输和保存方法

冰袋运输。

-20℃保存,有效期 1 年。

 

注意事项

1.  本试剂盒兼容范围为 1 ng – 1 μg Input DNA应尽可能使用 A260/A280 = 1.8-2.0 的高质量 Input DNA

2.  Input DNA 中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将 DNA 稀释在 ddH2O 或不含 EDTA

10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中进行片段化,EDTA 耐受范围为 0-2 mM

3. 对于常规的高质量基因组 DNA,酶切时间参考表 1。本试剂盒片段化偏好低,耐受各种 GC 含量的模板。

表 1 常规基因组 DNA 片段化时间推荐表

插入片段主峰大小

片段化时间

优化范围

600 bp

5 min

3-10 min

400 bp

10 min

8-15 min

250 bp

15 min

10-20 min

200 bp

20 min

12-25 min

150 bp

25 min

20-30 min

:以

4. 参考表 1 片段化时间可将 DNA 酶切为所需大小,为保证优质稳定的片段化效果,片段化过程请于冰上操作。

5. 该酶在高温条件下即可失活。

6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

7.本产品仅作科研用途!

 

使用方法

DNA 片段化(DNA Fragment

该步骤将基因组 DNA 片段化。

1. 将表 2 中试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 冰上配制表 2 反应体系。

2   DNA 片段化 PCR 反应体系

名称

体积(μL

Input   DNA

x

Hieff   ® Smearase

10

ddH2O

Up to   60 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述 PCR 管置于 PCR 仪,设置表 3 所示反应程序,进行 DNA 片段化反应。

 DNA 片段化 PCR 反应程序

温度

体积(μL

热盖 105°C

On

4 °C

1 min*

30 °C

3-30 min**

72 °C

10 min

4 °C

Hold

*DNA 片段反应44PCR PCR

**对于完整的基因组 DNA,酶切时间参考表 1

5. 产物如需纯化,可使用 Hieff NGS® DNA Selection BeadsCat#12601)或 AMPure XP BeadsCat#A63880)或其他等效产 品。

参考实例

使用 Hieff ® Smearase Human gDNA 样本进行酶切,片段化结果见图 1

 

 Hifair® Smearase 高通量测序酶切试剂 片段化酶

 Hieff ® Smearase 酶切 200 ng Human gDNA 样本(不同酶切时间片段化效果检测)

 

HB210527

 

 

Q12204ES12907ES 12609ES 区别与联系?

A12204 为完整的建库试剂盒,包含片段化模块,连接模块,扩增模块12609 为片段化模块,可同时进行样本的片段化,末端修复/A流程12907 为单酶(原料酶),仅用于DNA 片段化。

Q:12907里面的酶是什么酶?能否作用于RNA?产生的片段末端是平末端还是黏性末端?

A:是一些随机内切酶,作用于dsDNA,产生的末端是黏性末端。

Q:产品使用时能否用单酶搭配机械法流程建库试剂盒,如 12907+12199?

A:可以。实际使用时我们建议购买完整试剂盒(Cat#12204,该试剂盒经过流程的优化可获得优异的建库表现。如果想要购买 12907 搭配其他品牌建库试剂盒,建议片段化之后先进行纯化再接其他品牌建库试剂盒。

Q:酶切模块可否适用 MGI 平台?

A:片段化酶切模块 12907可通用于各类平台

QgDNA 片段化参考说明书酶切条件酶切 20 min,竟然切不动?

A一般优先考虑 DNA 的质量问题,比如 Input DNA 中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐离子,可能会影响酶切效果,建议将DNA 稀释在 ddH2O 或不含EDTA  10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再进行片段化。其次,如果样本是反转录得到的全长cDNA,则需考虑样本纯度问题。另外,对于环状DNA 的酶切,需要另行摸索酶切时间体系。特殊样本可考虑磁珠纯化之后进行酶切或适当延长酶切时间。

Q:酶切时间也不长,竟然过度酶切了?

A以插入片段 300 bp 为例,白细胞 gDNA30 度酶切 10min,出现如下图过度酶切现象。建议参考酶切条件需要考虑不同样本gDNA 大小,如白细胞gDNA 较小,应适当缩短酶切时间,否则易出现过度酶切现象

Q:最低可以切到多小片段?

A:有小片段保护机制,最低可到150bp左右。

[1] Zhang S, Pei Z, Lei C, et al. Detection of cryptic balanced chromosomal rearrangements using high-resolution optical genome mapping [published online ahead of print, 2022 Jun 16]. J Med Genet. 2022;jmedgenet-2022-108553. doi:10.1136/jmedgenet-2022-108553(IF:6.318)
[2] Ren J, Zhang R, Pan C, et al. Prevalence and genotype-phenotype correlations of GBA-related Parkinson disease in a large Chinese cohort. Eur J Neurol. 2022;29(4):1017-1024. doi:10.1111/ene.15230(IF:6.089)

Hieff ® Smearase 是针对高通量测序平台设计的新一代酶切试剂。本品采用高质量的片段化酶,酶切效果稳定,偏好性 低,可有效降低片段化的时间和成本,摆脱了繁琐的超声步骤,让片段化过程变得更加简单高效。

产品组分

组分编号

组分名称

8 T

24 T

96 T

12907

Hieff ® Smearase

80 μL

240 μL

960 μL

 

运输和保存方法

冰袋运输。

-20℃保存,有效期 1 年。

 

注意事项

1.  本试剂盒兼容范围为 1 ng – 1 μg Input DNA应尽可能使用 A260/A280 = 1.8-2.0 的高质量 Input DNA

2.  Input DNA 中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将 DNA 稀释在 ddH2O 或不含 EDTA

10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中进行片段化,EDTA 耐受范围为 0-2 mM

3. 对于常规的高质量基因组 DNA,酶切时间参考表 1。本试剂盒片段化偏好低,耐受各种 GC 含量的模板。

表 1 常规基因组 DNA 片段化时间推荐表

插入片段主峰大小

片段化时间

优化范围

600 bp

5 min

3-10 min

400 bp

10 min

8-15 min

250 bp

15 min

10-20 min

200 bp

20 min

12-25 min

150 bp

25 min

20-30 min

:以

4. 参考表 1 片段化时间可将 DNA 酶切为所需大小,为保证优质稳定的片段化效果,片段化过程请于冰上操作。

5. 该酶在高温条件下即可失活。

6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

7.本产品仅作科研用途!

 

使用方法

DNA 片段化(DNA Fragment

该步骤将基因组 DNA 片段化。

1. 将表 2 中试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 冰上配制表 2 反应体系。

2   DNA 片段化 PCR 反应体系

名称

体积(μL

Input   DNA

x

Hieff   ® Smearase

10

ddH2O

Up to   60 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述 PCR 管置于 PCR 仪,设置表 3 所示反应程序,进行 DNA 片段化反应。

 DNA 片段化 PCR 反应程序

温度

体积(μL

热盖 105°C

On

4 °C

1 min*

30 °C

3-30 min**

72 °C

10 min

4 °C

Hold

*DNA 片段反应44PCR PCR

**对于完整的基因组 DNA,酶切时间参考表 1

5. 产物如需纯化,可使用 Hieff NGS® DNA Selection BeadsCat#12601)或 AMPure XP BeadsCat#A63880)或其他等效产 品。

参考实例

使用 Hieff ® Smearase Human gDNA 样本进行酶切,片段化结果见图 1

 

 Hifair® Smearase 高通量测序酶切试剂 片段化酶

 Hieff ® Smearase 酶切 200 ng Human gDNA 样本(不同酶切时间片段化效果检测)

 

HB210527

 

 

Q12204ES12907ES 12609ES 区别与联系?

A12204 为完整的建库试剂盒,包含片段化模块,连接模块,扩增模块12609 为片段化模块,可同时进行样本的片段化,末端修复/A流程12907 为单酶(原料酶),仅用于DNA 片段化。

Q:12907里面的酶是什么酶?能否作用于RNA?产生的片段末端是平末端还是黏性末端?

A:是一些随机内切酶,作用于dsDNA,产生的末端是黏性末端。

Q:产品使用时能否用单酶搭配机械法流程建库试剂盒,如 12907+12199?

A:可以。实际使用时我们建议购买完整试剂盒(Cat#12204,该试剂盒经过流程的优化可获得优异的建库表现。如果想要购买 12907 搭配其他品牌建库试剂盒,建议片段化之后先进行纯化再接其他品牌建库试剂盒。

Q:酶切模块可否适用 MGI 平台?

A:片段化酶切模块 12907可通用于各类平台

QgDNA 片段化参考说明书酶切条件酶切 20 min,竟然切不动?

A一般优先考虑 DNA 的质量问题,比如 Input DNA 中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐离子,可能会影响酶切效果,建议将DNA 稀释在 ddH2O 或不含EDTA  10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再进行片段化。其次,如果样本是反转录得到的全长cDNA,则需考虑样本纯度问题。另外,对于环状DNA 的酶切,需要另行摸索酶切时间体系。特殊样本可考虑磁珠纯化之后进行酶切或适当延长酶切时间。

Q:酶切时间也不长,竟然过度酶切了?

A以插入片段 300 bp 为例,白细胞 gDNA30 度酶切 10min,出现如下图过度酶切现象。建议参考酶切条件需要考虑不同样本gDNA 大小,如白细胞gDNA 较小,应适当缩短酶切时间,否则易出现过度酶切现象

Q:最低可以切到多小片段?

A:有小片段保护机制,最低可到150bp左右。

[1] Zhang S, Pei Z, Lei C, et al. Detection of cryptic balanced chromosomal rearrangements using high-resolution optical genome mapping [published online ahead of print, 2022 Jun 16]. J Med Genet. 2022;jmedgenet-2022-108553. doi:10.1136/jmedgenet-2022-108553(IF:6.318)
[2] Ren J, Zhang R, Pan C, et al. Prevalence and genotype-phenotype correlations of GBA-related Parkinson disease in a large Chinese cohort. Eur J Neurol. 2022;29(4):1017-1024. doi:10.1111/ene.15230(IF:6.089)

Eton Bioscience品牌代理

Eton Bioscience

简要描述:

为了满足研究团体对DNA测序的需求,EtonBioscience还提供了各种各样的定制服务和自己的产品系列。

为了满足研究团体对DNA测序的需求,EtonBioscience还提供了各种各样的定制服务和自己的产品系列。最初只为当地服务,现在我们为世界各地的研究机构服务。


Eton Bioscience Inc. is a privately held company located in beautiful San Diego, the heart of the biotech scene. Founded in 2003, we contribute to both life and science, providing the biological research communities of academia and industry with services which assist them in their ongoing experiments and investigations.


品牌

货号

名称

规格

Eton Bioscience

2400090101

AMP-Activated Protein Kinase a1 subunit

10ug

Eton Bioscience

2400090301

AMP-Activated Protein Kinase a2 subunit

30ug

Eton Bioscience

2400120101

Ataxia Telangiectasia and Rad3 related, FRAP-related protein

10ug

Enzymatics品牌代理

Enzymatics

简要描述:

Enzymatics专注于于酶产品的研发,为市场带来了特殊的、高品质的产品。是一家试剂、试剂盒和测定的生产商,使全球客户变革了诊断、治疗和生命科学的研究。业务包括:试剂、供应链解决方案,应用科学,其测序产品80%。

Enzymatics专注于于酶产品的研发,为市场带来了特殊的、高品质的产品。是一家试剂、试剂盒和测定的生产商,使全球客户变革了诊断、治疗和生命科学的研究。业务包括:试剂、供应链解决方案,应用科学,其测序产品达80%。

酶科技公司产品包括八类:超纯连接酶如T4连接酶、超纯poly酶、ArcherTM系列测序工具(Archer Products)、连接蛋白、DNA修饰酶、NGS文库制备(NGS Library Construction)、核酸和RNA酶。


Enzymatics is pleased to announce the launch of ZipScript™ One-Step RT-qPCR mix, a high efficiency RNA-dependent multiplex qPCR formulation.


EnzScriptPhoenix Hot Start Taq产品列表:


品牌

名称

1

N2070-10-L

2

N2050-10-L

100 µmol

Enzymatics

100 mM 75µmol dNTP Solution Set75 µmol

Enzymatics

100 mM dATP Solution75 µmol

Enzymatics

100µmol dNTP Solution Mix100 µmol

Enzymatics

10x Uracil Cleavage System750 Reactions

Enzymatics

2x HiFi PCR Master Mix1 rxn

Enzymatics

5x ER/A-Tailing Enzyme Mix24 reactions

Enzymatics

5X WGS Fragmentation Mix24 Reactions

Enzymatics

Bst X DNA Polymerase40,000 U

Enzymatics

DNA Polymerase I5,000 U

Enzymatics

E. coli DNA Ligase2,500 U

Enzymatics

E. coli fpg4,000 U

Enzymatics

E. coli Pyrophosphatase50 U

Enzymatics

E. coli Single-Stranded DNA Binding Protein1.5 mg

<span microsoft=”” yahei”;=”” line-height:=”” 2;”=”” font-size:14px;line-height:2;”=”” style=”outline: none; font-size: 14px; font-family: “Microsoft YaHei”; line-height: 2;”>

CUT&Tag测序DNA Spike预混液

CUT&Tag测序DNA Spike预混液

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述

 

Hieff NGS® DNA Spike in Mix for CUT&Tag(5 ng/μL)是来源于大肠杆菌 Lambda DNA的三段序列,长度分别为230 bp、250 bp和300 bp,摩尔浓度比约为1:3:10。标准品主要用于在不同处理条件下或者不同细胞状态下CUT&Tag测序数据Normalization和定量分析。每10万投入量细胞加入1 μL即可,也可根据靶蛋白结合DNA能力和丰度自行调整。

 

产品组分

 

组分编号

组分名称

产品编号/规格

12596ES48

12596-A

DNA Spike in Mix5 ng/μL

48 μL

 

产品应用

 

本产品应用于Illumina平台的CUT&Tag文库校正

 

运输与保存方法

 

运输温度:0℃以下。-25~-15℃保存,有效期1年。

 

注意事项

 

1. 本产品的片段序列及具体的使用要求可参考Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® CUT&Tag建库试剂盒(Cat#12598ES

2. 该产品提供的DNA Spike-in Mix是三段来源于大肠杆菌λDNA序列,浓度为5 ng/μL,长度分别为230 bp、250 bp和300 bp,摩尔浓度比约为1:3:10实验时,建议将DNA Spike-in Mix用TE buffer稀释到5 pg/μL使用

3. 该产品主要用于不同处理条件或者细胞状态下的测序数据Normalization和定量分析,为非必需加入的组分。

4. 本产品仅做科研用途!

5. DNA Spike-in mix标准品的序列如下:

 

GTTCCACTCCTGAAGTGTCAAGTACATCGCAAAGTCTCCGCAATTACACGCAAGAAAAAACCGCCATCAGGCGGCTTGGTGTTCTTTCAGTTCTTCAATTCGAATATTGGTTACGTCTGCATGTGCTATCTGCGCCCATATCATCCAGTGGTCGTAGCAGTCGTTGATGTTCTCCGCTTCGATAACTCTGTTGAATGGCTCTCCATTCCATTCTCCTGTGACTCGGAAGT

AGTCGGTGTGAATCCCATCAGCGTTACCGTTTCGCGGTGCTTCTTCAGTACGCTACGGCAAATGTCATCGACGTTTTTATCCGGAAACTGCTGTCTGGCTTTTTTTGATTTCAGAATTAGCCTGACGGGCAATGCTGCGAAGGGCGTTTTCCTGCTGAGGTGTCATTGAACAAGTCCCATGTCGGCAAGCATAAGCACACAGAATATGAAGCCCGCTGCCA

 

GAAAAATGCATTCCGTGGTTGTCATACCT

CCTTACTGGAATCGATGGTGTCTCCGGTGTGAAAGAACACCAACAGGGGTGTTACCACTACCGCAGGAAAAGGAGGACGTGTGGCGAGACAGCGACGAAGTATCACCGACATAATCTGCGAAAACTGCAAATACCTTCCAACGAAACGCACCAGAAATAAACCCAAGCCAATCCCAAAAGAATCTGACGTAAAAACCTTCAACTACACGGCTCACCTGTGGGATATCCGGTGGCTAAGACGTCGTGCGAGGAAAACAAGGTGATTGACCAAAATCGAAGTTACGAACAAGAAAGCGTCGA

 

HB231219

CUT&amp;Tag测序DNA Spike预混液

暂无内容

CUT&amp;Tag测序DNA Spike预混液

暂无内容

产品描述

 

Hieff NGS® DNA Spike in Mix for CUT&Tag(5 ng/μL)是来源于大肠杆菌 Lambda DNA的三段序列,长度分别为230 bp、250 bp和300 bp,摩尔浓度比约为1:3:10。标准品主要用于在不同处理条件下或者不同细胞状态下CUT&Tag测序数据Normalization和定量分析。每10万投入量细胞加入1 μL即可,也可根据靶蛋白结合DNA能力和丰度自行调整。

 

产品组分

 

组分编号

组分名称

产品编号/规格

12596ES48

12596-A

DNA Spike in Mix5 ng/μL

48 μL

 

产品应用

 

本产品应用于Illumina平台的CUT&Tag文库校正

 

运输与保存方法

 

运输温度:0℃以下。-25~-15℃保存,有效期1年。

 

注意事项

 

1. 本产品的片段序列及具体的使用要求可参考Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® CUT&Tag建库试剂盒(Cat#12598ES

2. 该产品提供的DNA Spike-in Mix是三段来源于大肠杆菌λDNA序列,浓度为5 ng/μL,长度分别为230 bp、250 bp和300 bp,摩尔浓度比约为1:3:10实验时,建议将DNA Spike-in Mix用TE buffer稀释到5 pg/μL使用

3. 该产品主要用于不同处理条件或者细胞状态下的测序数据Normalization和定量分析,为非必需加入的组分。

4. 本产品仅做科研用途!

5. DNA Spike-in mix标准品的序列如下:

 

GTTCCACTCCTGAAGTGTCAAGTACATCGCAAAGTCTCCGCAATTACACGCAAGAAAAAACCGCCATCAGGCGGCTTGGTGTTCTTTCAGTTCTTCAATTCGAATATTGGTTACGTCTGCATGTGCTATCTGCGCCCATATCATCCAGTGGTCGTAGCAGTCGTTGATGTTCTCCGCTTCGATAACTCTGTTGAATGGCTCTCCATTCCATTCTCCTGTGACTCGGAAGT

AGTCGGTGTGAATCCCATCAGCGTTACCGTTTCGCGGTGCTTCTTCAGTACGCTACGGCAAATGTCATCGACGTTTTTATCCGGAAACTGCTGTCTGGCTTTTTTTGATTTCAGAATTAGCCTGACGGGCAATGCTGCGAAGGGCGTTTTCCTGCTGAGGTGTCATTGAACAAGTCCCATGTCGGCAAGCATAAGCACACAGAATATGAAGCCCGCTGCCA

 

GAAAAATGCATTCCGTGGTTGTCATACCT

CCTTACTGGAATCGATGGTGTCTCCGGTGTGAAAGAACACCAACAGGGGTGTTACCACTACCGCAGGAAAAGGAGGACGTGTGGCGAGACAGCGACGAAGTATCACCGACATAATCTGCGAAAACTGCAAATACCTTCCAACGAAACGCACCAGAAATAAACCCAAGCCAATCCCAAAAGAATCTGACGTAAAAACCTTCAACTACACGGCTCACCTGTGGGATATCCGGTGGCTAAGACGTCGTGCGAGGAAAACAAGGTGATTGACCAAAATCGAAGTTACGAACAAGAAAGCGTCGA

 

HB231219

CUT&amp;Tag测序DNA Spike预混液

暂无内容

CUT&amp;Tag测序DNA Spike预混液

暂无内容

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

操作手册

CUT&Tag实验操作指南   点击下载>>

 

产品信息

 

产品名称

产品编号

规格

Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®

CUT&Tag试剂盒(pA/G-Tn5版)

12598ES04

4 T

12598ES12

12 T

12598ES48

48 T

 

组分信息

 

组分编号

组分名称

12598ES04

12598ES12

12598ES48

BOX-I

12598-A

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

ConA Beads

40 μL

120 μL

480 μL

12598-B

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

DNA Selection Beads

400 μL

1.2 mL

4.8 mL

12598-C

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

Cell wash buffer

3.6 mL

10.8 mL

43.2 mL

12598-D

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

ConA bind buffer

400 μL

1.2 mL

4.8 mL

BOX-II

12598-E

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free)

40 μL

120 μL

480 μL

12598-F

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

5% Digitonin

15 μL

45 μL

180 μL

12598-G

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

3 M NaCl

80 μL

240 μL

960 μL

12598-H

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

50x Protein blocker

4 μL

12 μL

48 μL

12598-I

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

pA/G-Transposome Mix

4 μL

12 μL

48 μL

12598-J

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

30x Activating buffer

4 μL

12 μL

48 μL

12598-K

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

15x Terminate Solution

8 μL

24 μL

96 μL

12598-L

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

DNA Spike-in mix (5 pg/uL)

4 μL

12 μL

48 μL

12598-M

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

30x Proteinase K

4 μL

12 μL

48 μL

12598-N

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

Primer Mix

12 μL

36 μL

144 μL

12598-O

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

2×Ultima Amplification Mix

100 μL

300 μL

1.2 mL

12598-P

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

N5(N501) *

4 μL

NA

NA

12598-Q

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

N7(N701) *

4 μL

NA

NA

【注】:*测序时 Index 序列 填写时,测序平台为NovaSeq 6000 v1.0 reagents, MiSeq, HiSeq 2000/2500N501-CTCTCTAT,N701-TAAGGCGA。测序平台为NovaSeq 6000 v1.5 reagents,MiniSeq, NextSeq,HiSeq 3000/4000N501-ATAGAGAG,N701-TAAGGCGA。

 

储存条件

 

BOX-I:2-8℃保存,BOX-II:-25~-15℃保存,有效期1年。

 

 

CN20231208

 

Q:冻存组织和新鲜组织推荐哪个?

A:CUT&Tag推荐新鲜组织并制备细胞悬液,如果是冻存组织则需要制备细胞核,同时需要确保细胞核的完整性。植物细胞核提取方法可咨询金畔生物,我们有完整的植物细胞核提取方案。

Q:已知的转录因子,做CUT&tag实验,是否可以不测序,直接qPCR检测目的基因呢?

A:可以,但qPCR必须在文库扩增之后做,我们的spike-in可以作为内参进行相对定量。
Q:spike in mix 具体的作用是怎样的呢 ?

A:spike in主要用于对给实验数据定量提供依据,类似于内参的作用。对于不知道靶位点的目标蛋白或者处理条件会造成细胞内目标蛋白与DNA结合能力大幅度改变的情况,spike in能够帮助做出更准确的定量,反映这些情况造成的实验假阴性现象。此外,我们的spike in可以用于对目标DNA片段进行绝对定量,保证文章数据的准确性。

Q:做cut&tag总是duplicate多该怎么优化呢

A:可以适当提高细胞投入量和降低PCR循环数

Q:IgG对照可以不用做吗?

A:建议做的时候带一个IgG作为阴性对照来评判结合特异性。

Q:在实验过程中,观测到磁珠有凝聚现象怎么办?

A:过长的孵育时间尤其是4℃过夜的情况下,可能会出现部分磁珠凝聚的现象,一般情况下只要大部分磁珠仍处于溶液浸润范围内,则仍然能够得到正常的实验结果,继续进行后续实验即可。如果较大磁珠干结可能会加剧磁珠的凝聚

Q:对于DNA扩增和建库相关的试剂,如引物和扩增酶,能否使用其他来源的同类试剂?

A:不建议使用本试剂以外的试剂混搭进行实验。整个说明书的实验流程,包括PCR程序都是针对试剂盒内部所 提供的试剂进行优化的,引入任何非本试剂盒的试剂都可能会造成实验的失败。

Q:CUT&Tag目标片段富集的不够好是什么原因?如何改进?

A:二抗、转座体(加镁离子之前)洗涤不够充分;抗体特异性不好、抗体浓度太高等,建议确定所选抗体是否合适、增加抗体稀释度、增加洗涤次数来改善。

Q:阳性对照结果很,但是目标抗体没有好的富集?

A:(1)抗体问题,请选择可靠的ChIP抗体,尽量避免选择多肽免疫的抗体做CUT&Tag实验。

      (2)不同转录因子与DNA结合强度不同,研究对象会通过与其他蛋白形成复合物结合在特定的DNA片段上,必要时可以使用甲醛交联。弱结合的转录因子容易从目标DNA上脱落,另外PolII等转录因子结合的目标片段往往远少于组蛋白,因此打断后的DNA量较少回收效率低,建议适当增加细胞量。

Q:文库条带弥散,没有核小体峰,片段分布范围广?

A: (1)细胞或细胞核完整太低,细胞膜或核膜破裂等,核酸提前释放,导致非特异性酶切,建议细胞或细胞核提取时台盼蓝染色镜检细胞活性和细胞核完整性;(2)PCR扩增条件不合适,循环数太高,导致有大片段的非特异性扩增,和条带弥散。(3)富集问题,需要排除是否是抗体、磁珠富集等步骤是否存在操作问题等。

[1]Sun S, Jiang Y, Zhang Q, et al. Znhit1 controls meiotic initiation in male germ cells by coordinating with Stra8 to activate meiotic gene expression. Dev Cell. 2022;57(7):901-913.e4. doi:10.1016/j.devcel.2022.03.006(IF:13.417)

[2]Yan QY, Lv JL, Shen XY, et al. Patchouli alcohol as a selective estrogen receptor β agonist ameliorates AD-like pathology of APP/PS1 model mice. Acta Pharmacol Sin. 2022;43(9):2226-2241. doi:10.1038/s41401-021-00857-4(IF:7.169)

[3]Liang T, Bai J, Zhou W, et al. HMCES modulates the transcriptional regulation of nodal/activin and BMP signaling in mESCs. Cell Rep. 2022;40(2):111038. doi:10.1016/j.celrep.2022.111038(IF:9.995)

[4]Jiang H, Bian W, Sui Y, et al. FBXO42 facilitates Notch signaling activation and global chromatin relaxation by promoting K63-linked polyubiquitination of RBPJ. Sci Adv. 2022;8(38):eabq4831. doi:10.1126/sciadv.abq4831(IF:14.957)

[5]Kong X, Yan K, Deng P, et al. LncRNA-Smad7 mediates cross-talk between Nodal/TGF-β and BMP signaling to regulate cell fate determination of pluripotent and multipotent cells. Nucleic Acids Res. 2022;50(18):10526-10543. doi:10.1093/nar/gkac780(IF:19.160)

操作手册

CUT&Tag实验操作指南   点击下载>>

 

产品信息

 

产品名称

产品编号

规格

Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®

CUT&Tag试剂盒(pA/G-Tn5版)

12598ES04

4 T

12598ES12

12 T

12598ES48

48 T

 

组分信息

 

组分编号

组分名称

12598ES04

12598ES12

12598ES48

BOX-I

12598-A

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

ConA Beads

40 μL

120 μL

480 μL

12598-B

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

DNA Selection Beads

400 μL

1.2 mL

4.8 mL

12598-C

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

Cell wash buffer

3.6 mL

10.8 mL

43.2 mL

12598-D

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

ConA bind buffer

400 μL

1.2 mL

4.8 mL

BOX-II

12598-E

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free)

40 μL

120 μL

480 μL

12598-F

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

5% Digitonin

15 μL

45 μL

180 μL

12598-G

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

3 M NaCl

80 μL

240 μL

960 μL

12598-H

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

50x Protein blocker

4 μL

12 μL

48 μL

12598-I

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

pA/G-Transposome Mix

4 μL

12 μL

48 μL

12598-J

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

30x Activating buffer

4 μL

12 μL

48 μL

12598-K

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

15x Terminate Solution

8 μL

24 μL

96 μL

12598-L

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

DNA Spike-in mix (5 pg/uL)

4 μL

12 μL

48 μL

12598-M

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

30x Proteinase K

4 μL

12 μL

48 μL

12598-N

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

Primer Mix

12 μL

36 μL

144 μL

12598-O

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

2×Ultima Amplification Mix

100 μL

300 μL

1.2 mL

12598-P

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

N5(N501) *

4 μL

NA

NA

12598-Q

原位DNA结合图谱测序建库试剂盒 CUT&amp;Tag建库试剂盒/转座酶法建库试剂盒

N7(N701) *

4 μL

NA

NA

【注】:*测序时 Index 序列 填写时,测序平台为NovaSeq 6000 v1.0 reagents, MiSeq, HiSeq 2000/2500N501-CTCTCTAT,N701-TAAGGCGA。测序平台为NovaSeq 6000 v1.5 reagents,MiniSeq, NextSeq,HiSeq 3000/4000N501-ATAGAGAG,N701-TAAGGCGA。

 

储存条件

 

BOX-I:2-8℃保存,BOX-II:-25~-15℃保存,有效期1年。

 

 

CN20231208

 

Q:冻存组织和新鲜组织推荐哪个?

A:CUT&Tag推荐新鲜组织并制备细胞悬液,如果是冻存组织则需要制备细胞核,同时需要确保细胞核的完整性。植物细胞核提取方法可咨询金畔生物,我们有完整的植物细胞核提取方案。

Q:已知的转录因子,做CUT&tag实验,是否可以不测序,直接qPCR检测目的基因呢?

A:可以,但qPCR必须在文库扩增之后做,我们的spike-in可以作为内参进行相对定量。
Q:spike in mix 具体的作用是怎样的呢 ?

A:spike in主要用于对给实验数据定量提供依据,类似于内参的作用。对于不知道靶位点的目标蛋白或者处理条件会造成细胞内目标蛋白与DNA结合能力大幅度改变的情况,spike in能够帮助做出更准确的定量,反映这些情况造成的实验假阴性现象。此外,我们的spike in可以用于对目标DNA片段进行绝对定量,保证文章数据的准确性。

Q:做cut&tag总是duplicate多该怎么优化呢

A:可以适当提高细胞投入量和降低PCR循环数

Q:IgG对照可以不用做吗?

A:建议做的时候带一个IgG作为阴性对照来评判结合特异性。

Q:在实验过程中,观测到磁珠有凝聚现象怎么办?

A:过长的孵育时间尤其是4℃过夜的情况下,可能会出现部分磁珠凝聚的现象,一般情况下只要大部分磁珠仍处于溶液浸润范围内,则仍然能够得到正常的实验结果,继续进行后续实验即可。如果较大磁珠干结可能会加剧磁珠的凝聚

Q:对于DNA扩增和建库相关的试剂,如引物和扩增酶,能否使用其他来源的同类试剂?

A:不建议使用本试剂以外的试剂混搭进行实验。整个说明书的实验流程,包括PCR程序都是针对试剂盒内部所 提供的试剂进行优化的,引入任何非本试剂盒的试剂都可能会造成实验的失败。

Q:CUT&Tag目标片段富集的不够好是什么原因?如何改进?

A:二抗、转座体(加镁离子之前)洗涤不够充分;抗体特异性不好、抗体浓度太高等,建议确定所选抗体是否合适、增加抗体稀释度、增加洗涤次数来改善。

Q:阳性对照结果很,但是目标抗体没有好的富集?

A:(1)抗体问题,请选择可靠的ChIP抗体,尽量避免选择多肽免疫的抗体做CUT&Tag实验。

      (2)不同转录因子与DNA结合强度不同,研究对象会通过与其他蛋白形成复合物结合在特定的DNA片段上,必要时可以使用甲醛交联。弱结合的转录因子容易从目标DNA上脱落,另外PolII等转录因子结合的目标片段往往远少于组蛋白,因此打断后的DNA量较少回收效率低,建议适当增加细胞量。

Q:文库条带弥散,没有核小体峰,片段分布范围广?

A: (1)细胞或细胞核完整太低,细胞膜或核膜破裂等,核酸提前释放,导致非特异性酶切,建议细胞或细胞核提取时台盼蓝染色镜检细胞活性和细胞核完整性;(2)PCR扩增条件不合适,循环数太高,导致有大片段的非特异性扩增,和条带弥散。(3)富集问题,需要排除是否是抗体、磁珠富集等步骤是否存在操作问题等。

[1]Sun S, Jiang Y, Zhang Q, et al. Znhit1 controls meiotic initiation in male germ cells by coordinating with Stra8 to activate meiotic gene expression. Dev Cell. 2022;57(7):901-913.e4. doi:10.1016/j.devcel.2022.03.006(IF:13.417)

[2]Yan QY, Lv JL, Shen XY, et al. Patchouli alcohol as a selective estrogen receptor β agonist ameliorates AD-like pathology of APP/PS1 model mice. Acta Pharmacol Sin. 2022;43(9):2226-2241. doi:10.1038/s41401-021-00857-4(IF:7.169)

[3]Liang T, Bai J, Zhou W, et al. HMCES modulates the transcriptional regulation of nodal/activin and BMP signaling in mESCs. Cell Rep. 2022;40(2):111038. doi:10.1016/j.celrep.2022.111038(IF:9.995)

[4]Jiang H, Bian W, Sui Y, et al. FBXO42 facilitates Notch signaling activation and global chromatin relaxation by promoting K63-linked polyubiquitination of RBPJ. Sci Adv. 2022;8(38):eabq4831. doi:10.1126/sciadv.abq4831(IF:14.957)

[5]Kong X, Yan K, Deng P, et al. LncRNA-Smad7 mediates cross-talk between Nodal/TGF-β and BMP signaling to regulate cell fate determination of pluripotent and multipotent cells. Nucleic Acids Res. 2022;50(18):10526-10543. doi:10.1093/nar/gkac780(IF:19.160)

长读长测序技术痛点:DNA提取速度、产量是关键

本文转自测序中国 作者:戴胜 

近年来,Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies、Bionano Genomics和10x Genomics等公司的长读长测序和基因组图谱技术越来越受欢迎。随着相关技术的推广应用,长读长测序技术在快速、高效提取高质量高分子量DNA方面的痛点日益凸显。

长读长测序技术痛点:DNA提取速度、产量是关键

在过去的基因组研究中,人们可能会更多的选择短读长测序。现在,那些新开展的基因测序研究更愿意选择PacBio、Oxford Nanopore、Biona0x Genomics等公司的技术。例如将为地球上所有66,000种脊椎动物物种生成参考基因组的脊椎动物基因组计划(VGP),就已承诺在研究中使用高通量基因组图谱技术和长读长测序技术。

利用目前已有的许多DNA提取标准方法,如色谱柱法和磁珠法,获得高分子量DNA并不容易。大多数用户终选择的还是非常传统的方法,如琼脂糖包埋纯化,通过将DNA嵌入琼脂糖凝胶中以保护其免受溶液体系剪切力的影响;或者进行苯酚氯方萃取沉淀。这些方法可以提供纯化的长DNA片段,但缺点是速度慢,难以实现规模化生产

洛克菲勒大学脊椎动物基因组学实验室将为VGP项目提供测序数据,该实验室主任Olivier Fedrigo表示,BioNano的图谱平台需要200Kb及以上的DNA片段,其他技术如PacBio和10x Genomics则可以获取更短的DNA片段,但实验室决定采取一种适用于所有情况的DNA提取方法。DNA片段不仅要非常长,还要非常纯,不存在蛋白质或其他污染物,这对纳米孔测序尤为重要。

目前,该研究团队已经决定使用Bionano的一种琼脂糖凝胶提取试剂盒及方案,该方案可提取超过250Kb的DNA片段,适用于本所有的下游应用,并适用于不同样本类型,包括动物组织、血液、细胞系和植物。但问题在于,该方案流程为7~10天,并且很难实现自动化,产量不足以进行PacBio测序,一旦开始用于VGP的高通量基因组组装就会出现问题。因此研究团队必须调整Bionano的试剂盒,提高DNA产量。

从个体基因组中获取长片段DNA,是进行基因组测序的关键。Bionano和Nanopore等公司获取真正长DNA片段信息主要依赖于DNA的高分子量提取。为了从人的细胞中提取纳米孔测序用的长片段DNA样本,英国伯明翰大学Josh Quick研究员与同事使用了传统的苯酚-氯方制备技术,该技术已经沿用了数十年,可使DNA保持较高的浓度,并在一定程度保持DNA片段的长度。但遗憾的是,这种方法同样难以自动化。人们往往喜欢谈论获得的长read,但那只是为了吸引客户,真正需要关心的N50。重要的是,获得的长片段DNA有多少是可用的?

多家公司已经接受了这项挑战,如Circulomics、Bionano、Sage Science和RevoluGen,其共同目的是开发一种高通量方法,可从不同的样品类型中提取数百Kb和长达Mb的DNA分子。此外,一些学术团体也一直在开发自用的提取方法,以满足研究中的特定需求。下面,我们一起看看这些公司的研究进展。

Bionano Genomics

Bionano 公司一直在开发提取高质量超高分子量DNA的方法。使用的是经过多年研制的琼脂糖凝胶化学试剂,并提供了有关DNA长度的标准。公司内部和第三方合作伙伴都在努力开发更快、更自动化的样本制备方法,并计划在未来的几个月内发布新产品。

改进样品制备方法,首先要以保持DNA完整性的方式收集和储存样本。如果开始使用的样本就很差劲,也就无法提取高质量的DNA。目前,Bionano已经可提供用于冷冻和处理的哺乳动物血液样本的方案,并正在研究其他各种组织样本的处理方案。

在DNA提取方面,Bionano正在投资不使用琼脂糖凝胶的替代样本制备方案和试剂盒,其速度更快且是自动化的。据悉,该试剂盒可提取高纯度的DNA,平均片段长度为250Kb以上。同时,该公司正在研究新的解决方案和杂质去除方法。目的是即在相同工作流程时间内(几小时内),达到NGS测序的DNA提取标准。许多用户会对快速且不需要贵重设备的提取试剂盒感到满意,自动化将有助于其扩展到一次进行更多样本的检测应用。

Circulomics

Circulomics公司一直与Bionano合作开发新的DNA提取技术。该公司开发了一种Nanobind技术,其原理类似于常规的磁珠提取DNA ,但该技术不会使用数百万的小颗粒,而是利用具有纳米结构二氧化硅表面的小磁盘与DNA结合,其表面会保护DNA不被剪切。在不同的仪器类型中使用,Nanobind可在半小时内处理12到96个样本,可在1小时左右获得数百Kb的DNA片段。Nanobind有一个自动化版本,可在赛默飞世尔科技的KingFisher平台运行。

通常情况下,DNA分子必须被剪切到合适的尺寸才能更好的进行测序检测。Circulomics采用两种策略,一种是使DNA长达数百Kb,满足长读长测序要求;另一种是为Bionano等应用产生超高分子量的DNA,以适用于任何提取试剂盒。此外,Circulomics还在开发DNA文库制备纯化方法,同样使用纳米磁盘作为提取工具,但使用不同的化学物质去除短DNA片段、盐或蛋白质。

目前,Circulomics公司销售两种Nanobind DNA提取试剂盒:一种用于细胞、细菌或血液,另一种用于植物细胞核。此外,该公司正在利用研发中的试剂为不常见样本提供定制化DNA提取服务。同时,Circulomics还在开发一种用于组织DNA提取的商业试剂盒,可适用于多种生物和组织样本。这将涉及一些特殊的同质化步骤和杂质去除方法,尚难以实现自动化。

Sage Science

2017年,Sage Science公司推出了一种用于提取高分子量DNA的仪器,名为Sage HLS。该系统采用电泳技术,每次多可处理四个样本,包括细胞、细胞核或球形细胞的悬浮液。整个制备过程需要2~6小时,DNA可保持数Mb大小,并缠绕在样本的琼脂糖壁中。在加入非特异性酶或CRISPR/Cas9复合物后,DNA被切割,并分离纯化。

Sage Science方面表示,Sage HLS的一个主要优点就是,DNA分子不会暴露在粘滞剪切下,因此可以分离出非常高分子量的DNA,大小可达2Mb。此外,研究人员已经在利用Cas介导的系统分离50~400Kb之间的DNA片段,并正努力将范围增大到1Mb。

RevoluGen

英国的RevoluGen是另一家致力于开发高分子量DNA提取新方法的公司。该公司开发了一种名为Fire Monkey的自旋柱试剂盒,其使用的专有技术可确保DNA保持完整,工作流程约为1小时

RevoluGen方面表示,依赖*的溶液和基质化学成分,在任何环节都不会像其他自旋柱试剂盒那样破坏DNA。Fire Monkey获得的DNA尺寸高达500 Kb,如果是新鲜样本,平均片段大小可大于100 Kb。此外,与其他方法提取的DNA相比,该方法获得的DNA具有较少的缺口,可减少对长读长测序的干扰

Fire Monkey可以被复用,处理样本数量几乎不受限制。此外,该方法也可通过磁珠技术实现自动化,目前该公司尚未进行相关工作。实现自动化的一个挑战就是,DNA往往长、短片段混合在一起。为了解决这一问题,RevoluGen开发了一种名为Fire Flow的DNA大小分离技术,可在文库制备过程中去除10Kb及以下的DNA片段。

参考资料:

DNA Extraction Remains Bottleneck for Long-Read Techs But Solutions Begin to Emerge