该试剂盒可以将Illumina试剂盒构建的双链线性文库转化为兼容华大智造测序平台的环状ssDNA文库。构建的文库可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 进行测序。
产品组分
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组分编号与名称
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13342ES16
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13342ES96
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13342-A
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AC-PCR Amplification mix
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400 μL
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2×1200 μL
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13342-B
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AC-PCR Primer mix
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16 μL
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96 μL
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13342-C
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App-A Splint Buffer
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240 μL
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2×720 μL
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13342-D
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Ligase
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80 μL
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480 μL
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13342-E
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Digestion Buffer
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130 μL
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780 μL
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13342-F
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Digestion Enzyme
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32 μL
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192 μL
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运输与保存方法
干冰运输。
所有组分-20°C保存，有效期1年。
*当运输条件、储存条件及使用方式都正确时，所有组分在有效期内均能保持完整活性。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. 定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
7. 本产品仅作科研用途！
二、样本要求及处理
2.1样本要求
样本为线性dsDNA文库，接头序列符合下列之一：
单index：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
双index：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
线性dsDNA文库插入片段范围为 100 ~ 500 bp，同时主带集中在±100 bp 以内。
2.2 样本量要求
根据文库总量选择合适的线性dsDNA投入量，详见表1：
表1 线性dsDNA总量与浓度要求
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线性dsDNA文库投入量(ng)
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线性dsDNA文库总量(ng)
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线性dsDNA文库浓度要求(ng/μl)
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10
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≤25
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＞0.45
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25
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25＜文库总量＜50
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1＜文库浓度＜2.1
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50
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＞50
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＞2.1
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2.3 转换PCR
不同线性 dsDNA 文库投入量，所需 PCR 循环也不相同，详见表2：
表2 不同线性dsDNA投入量PCR循环数推荐表
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线性dsDNA文库投入量(ng)
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推荐PCR循环数
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10
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8
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25
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7
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50
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6
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2.4 转换文库pooling要求
1. 不推荐在转换PCR前对线性dsDNA进行pooling。
2. 需将接头转换 PCR 产物混合测序，则 Sample Barcode Pooling 应遵循碱基平衡的原则：最佳平衡状态 ATGC 4种碱基的占比应分别为 25% ，若不能达到 25%，则要保证每个 cycle 都存在 ATGC 四种碱基序列，并且最少的碱基不应低于 12.5%，最多的碱基不应高于 62.5%。
3. 不同片段长度的文库不建议 pooling 环化。
4. 若样本所需数据量相同且长度相同，则可以等量混合，每个样本所需的质量按照公式1进行计算：
公式1混合样本中单个样本所需质量的计算
单个样本所需的质量 (ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量 (ng）/混合的样本个数 N
5. 混合后接头转换 PCR 产物总量为 1 pmol，总体积最多为 40 μL；若文库不足则用 TE buffer补充至 40 μL
三、关于磁珠纯化（Bead-based Clean Up）
1. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致纯化得率下降。
2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥约5 min。
5. 单链环产物纯化保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于-20°C可保存1个月。
四、关于文库质检（Library Quality Analysis）
1. 转换文库推荐使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等双链 DNA 进行定量， 要求最终接头转换 PCR产物的摩尔产量至少为 1 pmol，可根据公式2计算或参考表2。
公式2 PCR 产物摩尔数与质量间的换算
1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66
表3 不同片段大小PCR产物1 pmol对应产量
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PCR产物主片段大小（bp）
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1 pmol对应产量（ng）
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300
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198
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350
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231
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400
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264
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450
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297
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500
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330
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2. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。
3. 单链环状 DNA 产物纯化后产量应达到 60 fmol 以上方足够一次上机测序的量，可根据公式3计算或参考表3 。
公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
60 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33
表4 不同PCR产物片段大小对应60 fmol单链环产量
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PCR产物主片段大小（bp）
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60 fmol对应产量（ng）
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300
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5.94
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350
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6.93
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400
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7.92
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450
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8.91
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500
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9.90
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使用方法
一、自备材料
1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. 文库质控：Cat#12640，dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642，1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效产品。
3. 单链环质控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效产品。
3. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
图1 通用文库转换流程
三、操作步骤
Part A接头转换PCR
1.转换PCR
该步骤对线性dsDNA文库进行转换-转化为可以进行后续环化的线性dsDNA文库。
将表5中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。
表5 转换PCR扩增反应体系
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名称
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体积（μL）
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AC-PCR Amplification Mix
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25
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AC-PCR Primer Mix
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1
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线性dsDNA 文库
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ddH2O
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|
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Total
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50
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3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表6所示反应程序，进行PCR扩增。
表6 PCR扩增反应程序
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温度
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时间
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循环数
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98°C
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1 min
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1
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98°C
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10 sec
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参照注意事项中表2
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60°C
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30 sec
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72°C
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30 sec
|
|
72°C
|
5 min
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1
|
|
4°C
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Hold
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–
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2、转换PCR产物纯化
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads : DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：加入32 μL TE buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。
9. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移30 μL上清至干净的管中。
3、转换PCR产物质检
使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等转换PCR产物进行定量，具体请参见注意事项四。
Part B 转换文库环化
1 变性
1. 根据文库长度，取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中，用 TE Buffer 补充至总体积 40 μL。
4. 混匀后，在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min，之后立即置于冰上，冰浴 2 min 后瞬时离心。
2 单链环化
1. 将表7中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于冰上配制表7反应体系。
表7 单链环化体系
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名称
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体积（μL）
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|
上一步反应物
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40
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App-A Splint Buffer
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15
|
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Ligase
|
5
|
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Total
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60
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3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表8所示摄制反应程序，进行单链环化反应。
表8 单链环化反应程序
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温度
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时间
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热盖105°C
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OFF
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37°C
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15 min
|
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4°C
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Hold
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3 酶切消化
1. 将表9中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于冰上配制表9所示反应体系。
表9 酶切消化体系
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名称
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体积（μL）
|
|
上一步反应物
|
60
|
|
Digestion Buffer
|
8
|
|
Digestion Enzyme
|
2
|
|
Total
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70
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3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表10的条件进行反应：
表10 酶切消化反应程序
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温度
|
时间
|
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热盖105°C
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OFF
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37°C
|
10 min
|
|
4°C
|
Hold
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5. 反应结束后，瞬时离心，立即进行纯化。
4 消化产物纯化
该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中，室温孵育10min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约2 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置10 min。
9. 短暂离心，将 PCR 管始终置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 2min），将上清小心移至新 PCR 管中， -20℃保存，待制备 DNB。
5 消化产物质控
使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量，具体请参见注意事项四。
HB220117
