E.coli DNA ligase DNA连接酶　NGS甲基化建库DNA连接酶

发表于2024年3月11日由上海金畔生物科技有限公司

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

E. coli DNA ligase可以催化相邻DNA链的5’-PO4末端与3’-OH末端形成磷酸二酯键，对平末端底物DNA几乎无明显连接活性。其反应的最适pH为7.5-8.0（Tris-HCl buffer），反应需NAD作为辅酶。与T4 DNA Ligase可连接粘性末端和平末端相比，本酶只能催化突出末端DNA之间的连接，但如果在PEG及高浓度一价阳离子存在的条件下，也能连接平滑末端的DNA。另外，本款产品不能催化DNA与RNA以及RNA之间的连接反应。

该酶可以用于NGS甲基化建库中进行连接反应，另外也可以用于Okayama-Berg法克隆cDNA。

产品信息

货号	14955ES75/14955ES82/14955ES92
规格	300 U/1,200 U/12,000 U

组分信息

组分编号	组分名称	14955ES75	14955ES82	14955ES92
14955-A	E. coli DNA ligase (60 U/μL)	5 μL	20 μL	200 μL
14955-B	10×E. coli DNA ligase Buffer	30 μL	100 μL	1 mL
14955-C	10×BSA*(0.05%)	30 μL	100 μL	1 mL

* BSA应避免反复冻融，短期时间内使用可置于4℃

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

1.在无菌微量离心管中配制以下反应体系：

组分	体积
DNA	1 μg
10×E. coli DNA ligase Buffer	2 μL
E. coli DNA ligase (60 U/μL)	1 μL
10×BSA(0.05%)	2 μL
灭菌水	Up to 20 μL

2. 16℃温育1 h或过夜。

注意事项

1. Buffer在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请颠倒混匀后使用。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！

Ver.CN20231017

该酶可以用于NGS甲基化建库中进行连接反应，另外也可以用于Okayama-Berg法克隆cDNA。

产品信息

货号	14955ES75/14955ES82/14955ES92
规格	300 U/1,200 U/12,000 U

组分信息

组分编号	组分名称	14955ES75	14955ES82	14955ES92
14955-A	E. coli DNA ligase (60 U/μL)	5 μL	20 μL	200 μL
14955-B	10×E. coli DNA ligase Buffer	30 μL	100 μL	1 mL
14955-C	10×BSA*(0.05%)	30 μL	100 μL	1 mL

* BSA应避免反复冻融，短期时间内使用可置于4℃

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

1.在无菌微量离心管中配制以下反应体系：

组分	体积
DNA	1 μg
10×E. coli DNA ligase Buffer	2 μL
E. coli DNA ligase (60 U/μL)	1 μL
10×BSA(0.05%)	2 μL
灭菌水	Up to 20 μL

2. 16℃温育1 h或过夜。

注意事项

1. Buffer在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请颠倒混匀后使用。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！

Ver.CN20231017

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E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

发表于2024年3月8日由上海金畔生物科技有限公司

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E.coli残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测E.coli细胞的残留DNA，其最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
组分编号	组分名称	41308ES50 (50T)	41308ES60 (100T)
41308-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41308-B	E.coli Primer&Probe Mix	250 μL	500 μL
41308–C	DNA Dilution Buffer	2×1.8 mL	4×1.8 mL
41308–D	E.coli DNA Control (30 ng/μL)	25 μL	50 μL

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输，-20℃保存，有效期2年。且41308-A和41308–B均需避光保存。

2. 收到货后，请检查共4个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途。

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

使用方法

一、E.coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的E.coli DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2. 取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0，Std1，Std2，Std3，Std4，Std5。

3. 在标记为Std0的1.5 mL离心管中加入90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL E.coli DNA Control (30 ng/μL)，即稀释为3 ng/μL，振荡混匀后短暂快速离心10 sec，该浓度可分装置于-20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

4. 在Std1，Std2，Std3，Std4，Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于–20℃。

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

二、样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加30 pg E.coli DNA量的ERC为例），具体操作如下：

1. 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2. 加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

三、阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1. 取100 μL样本基质溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

四、无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液（即15 μL E.coli qPCR Mix + 5μL E.coli Primer&Probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

五、反应体系

组分	体积（μL）
E.coli qPCR Mix	15
E.coli Primer&Probe Mix	5
DNA template	10
总体积	30

【注】：

1.根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+5) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

2. 反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如30 pg标准品DNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

3. 加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下图为参考板位：

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

该示例是对E.coli残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度的E.coli DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个样本加标回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

六、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1.创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.创建1个检测探针，命名为“E.coli-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”，参比荧光为“ROX”

（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

3.在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”，“30000”，“3000”，“300”，“30”（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“sample name”一栏中命名为“300 pg/μL”，“30 pg/μL”，“3 pg/μL”，“300 fg/μL”，“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”，“TS”，“ERC”；之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4. 扩增程序设置：设置反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
预变性	95℃	10 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec	40

七、qPCR 结果分析

1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲：R²>0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4. 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5. 根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.pg) x 100%。

6. 阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7. 无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。

HB221130

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E.coli残留DNA含量的试剂盒。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
组分编号	组分名称	41308ES50 (50T)	41308ES60 (100T)
41308-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41308-B	E.coli Primer&Probe Mix	250 μL	500 μL
41308–C	DNA Dilution Buffer	2×1.8 mL	4×1.8 mL
41308–D	E.coli DNA Control (30 ng/μL)	25 μL	50 μL

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输，-20℃保存，有效期2年。且41308-A和41308–B均需避光保存。

2. 收到货后，请检查共4个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途。

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

使用方法

一、E.coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的E.coli DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2. 取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0，Std1，Std2，Std3，Std4，Std5。

4. 在Std1，Std2，Std3，Std4，Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于–20℃。

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

二、样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加30 pg E.coli DNA量的ERC为例），具体操作如下：

1. 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2. 加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

三、阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1. 取100 μL样本基质溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

四、无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液（即15 μL E.coli qPCR Mix + 5μL E.coli Primer&Probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

五、反应体系

组分	体积（μL）
E.coli qPCR Mix	15
E.coli Primer&Probe Mix	5
DNA template	10
总体积	30

【注】：

1.根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+5) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

2. 反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如30 pg标准品DNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

下图为参考板位：

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

六、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1.创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.创建1个检测探针，命名为“E.coli-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”，参比荧光为“ROX”

（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

4. 扩增程序设置：设置反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
预变性	95℃	10 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec	40

七、qPCR 结果分析

4. 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

6. 阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7. 无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。

HB221130

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

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大肠杆菌宿主细胞RNA残留检测试剂盒(E.coli Host Cell RNA Residue Detection Kit)

发表于2024年3月8日由上海金畔生物科技有限公司

大肠杆菌宿主细胞RNA残留检测试剂盒(E.coli Host Cell RNA Residue Detection Kit)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

E.coli宿主细胞RNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中残留的E.coli总RNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测E.coli细胞残留的总RNA，定量限低至1 fg/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)及Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)配套使用。

组分信息

组分编号	组分名称	41318ES50	41318ES60
41318-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41318-B	One Step Enzyme Mix	200 μL	400 μL
41318-C	RNA Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41318-D	E.coli RNA Control（20 ng/μL）	25 μL	50 μL
41318-E	IC^*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，内部对照

运输和储存条件

1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41318-A需避光保存。

2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

使用说明

1. E.coli RNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的RNA Dilution Buffer（RNA稀释液）将E.coli RNA Control定量参考品进行梯度稀释^*，稀释浓度依次为2 ng/μL、200 pg/μL、20 pg/μL、2 pg/μL、200 fg/μL、20 fg/μL、2 fg/μL。

具体操作如下：

1）将试剂盒中的E.coli RNA Control定量参考品和RNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2）取7支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

3）在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL RNA Dilution Buffer和10 μL E.coli RNA Control定量参考品，Std0即稀释为2 ng/μL的浓度，振荡混匀后低速离心10 sec，该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过3个月）^**，使用时避免反复冻融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6离心管中先分别加入90 μL RNA Dilution Buffer^***，再进行梯度稀释^****，具体稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 fg/μL
Std6	10 μL Std5 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 fg/μL

表1 标准品梯度稀释

^*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试200 pg/μL~2 fg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

^**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将RNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

^***已融化未使用的RNA稀释液可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。

^****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约15 sec。

2. 待测样本的前处理

1）样本中残留RNA的提取纯化可采用本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)。

2）待测样本在使用E.coli残留RNA试剂盒做qPCR检测前，需要进行DNase^*处理，以消除gDNA对qPCR检测的影响。

3）DNase用量和消化条件需按实际样品优化，可咨询金畔生物获取相关建议。

^*本试剂盒不含DNase试剂，推荐您购买本公司的Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)。14534ES50规格50U的酶量对应E.coli残留RNA检测试剂盒41318ES50的50T规格的用量，同理14534ES60规格100U的酶量对应41318ES60的100T规格的用量。

3. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的E.coli RNA标准品浓度（以制备加20 pg E.coli RNA量的ERC为例^*），具体操作如下：

1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2）加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

^*一般建议样本加标量设置在样本中宿主细胞RNA实际残留量的0.8~1.5倍，如果样品中RNA残留量低于定量限，加标量应设置到定量限之内，以保证检测结果可靠。

4. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1）取100 μL样本基质溶液（或RNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

5. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留RNA含量阶段开始配置即可。

2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液（15 μL E.coli qPCR Mix + 4 μL One Step Enzyme Mix + 1 μL IC）+ 10 μL RNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

6. 反应体系

组分	体积(μL)
E.coli qPCR Mix^*	15
One Step Enzyme Mix	4
IC	1
RNA Template^**	10
总体积^***	30

表2 标准品反应体系

^*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

^**反应孔数=（6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：RNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或RNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如10 μL的2 pg/μL标准品RNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

^***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下表为参考板位：

NTC

待测样本TS1

标准曲线Std1

NTC

待测样本TS2

标准曲线Std2

NTC

待测样本TS3

标准曲线Std3

标准曲线Std4

NCS

样本加标ERC1

标准曲线Std5

NCS

样本加标ERC2

标准曲线Std6

NCS

样本加标ERC3

表3 上机参考板位

该示例是对E.coli残留RNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：6个浓度梯度的E.coli RNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

7. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2）创建2个检测探针，Target 1命名为“E.coli-RNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；

Target 2命名为“IC”，选择报告荧光基团为“VIC”，猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“200000”、“20000”、“2000”、“200”、“20”、“2”（含义为每孔RNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“200 pg/μL”、“20 pg/μL”、“2 pg/μL”、“200 fg/μL”、“20 fg/μL”、“2 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”，参比荧光勾选“ROX”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4）扩增程序设置：设置三步法扩增程序，反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
逆转录	50℃	20 min	1
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec	40

表4 扩增程序

8. qPCR结果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5）根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%～150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / RNA加入量理论值(eg.pg)×100%。

6）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。

8）待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大，则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本，则优先考虑样本加标回收率结果，IC结果作为参考。

Ver.CN20230830

E.coli宿主细胞RNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中残留的E.coli总RNA含量的试剂盒。

组分信息

组分编号	组分名称	41318ES50	41318ES60
41318-A	E.coli qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41318-B	One Step Enzyme Mix	200 μL	400 μL
41318-C	RNA Dilution Buffer	1.8 mL×2管	1.8 mL×4管
41318-D	E.coli RNA Control（20 ng/μL）	25 μL	50 μL
41318-E	IC^*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，内部对照

运输和储存条件

1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41318-A需避光保存。

2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

使用说明

1. E.coli RNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

具体操作如下：

1）将试剂盒中的E.coli RNA Control定量参考品和RNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2）取7支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6离心管中先分别加入90 μL RNA Dilution Buffer^***，再进行梯度稀释^****，具体稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL RNA Dilution Buffer	200 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL RNA Dilution Buffer	20 fg/μL
Std6	10 μL Std5 + 90 μL RNA Dilution Buffer	2 fg/μL

表1 标准品梯度稀释

^*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试200 pg/μL~2 fg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

^**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将RNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

^***已融化未使用的RNA稀释液可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。

^****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约15 sec。

2. 待测样本的前处理

1）样本中残留RNA的提取纯化可采用本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)。

2）待测样本在使用E.coli残留RNA试剂盒做qPCR检测前，需要进行DNase^*处理，以消除gDNA对qPCR检测的影响。

3）DNase用量和消化条件需按实际样品优化，可咨询金畔生物获取相关建议。

3. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的E.coli RNA标准品浓度（以制备加20 pg E.coli RNA量的ERC为例^*），具体操作如下：

1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2）加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

4. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1）取100 μL样本基质溶液（或RNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

5. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留RNA含量阶段开始配置即可。

2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液（15 μL E.coli qPCR Mix + 4 μL One Step Enzyme Mix + 1 μL IC）+ 10 μL RNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

6. 反应体系

组分	体积(μL)
E.coli qPCR Mix^*	15
One Step Enzyme Mix	4
IC	1
RNA Template^**	10
总体积^***	30

表2 标准品反应体系

^*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

^**反应孔数=（6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：RNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或RNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如10 μL的2 pg/μL标准品RNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

下表为参考板位：

NTC

待测样本TS1

标准曲线Std1

NTC

待测样本TS2

标准曲线Std2

NTC

待测样本TS3

标准曲线Std3

标准曲线Std4

NCS

样本加标ERC1

标准曲线Std5

NCS

样本加标ERC2

标准曲线Std6

NCS

样本加标ERC3

表3 上机参考板位

7. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2）创建2个检测探针，Target 1命名为“E.coli-RNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；

4）扩增程序设置：设置三步法扩增程序，反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
逆转录	50℃	20 min	1
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec	40

表4 扩增程序

8. qPCR结果分析

4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

6）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。

Ver.CN20230830

大肠杆菌宿主细胞RNA残留检测试剂盒(E.coli Host Cell RNA Residue Detection Kit)

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E.coli残留DNA检测试剂盒|E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

发表于2024年3月7日由上海金畔生物科技有限公司

E.coli残留DNA检测试剂盒|E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E.coli残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测E.coli细胞的残留DNA，其最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒需可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（Cat#18461ES/18462ES）配套使用。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
组分编号	组分名称	41304ES50（50T）	41304ES60（100T）
41304-A	E.coli qPCR mix	0.9 mL	1.8 mL
41304-B	E.coli Primer&probe mix	100 μL	200 μL
41304-C	DNA Dilution Buffer	2×2 mL	4×2 mL
41304-D	E.coli DNA Control（30 ng/μL）	25 μL	50 μL

【注】：本试剂盒不含ROX参比染料，若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料，推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输，-20℃保存，有效期2年。

2. 收到货后，请检查共4个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI Quant Studio 5；ABI Step OnePlus.

使用方法

一、E.coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2. 取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为3 ng/μL，①，②，③，④，⑤。

3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加入90 μL DNA稀释液和10 μL DNA定量参考品（30 ng/μL），即稀释为3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心10 sec，该浓度可分装置于–20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

4. 在 ①，②，③，④，⑤ 管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
②	10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
③	10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
④	10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
⑤	10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于–20℃。

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天，若长时间不用，请放置于–20℃。

4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

二、样本加标回收质控QC的制备

根据需要设QC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例），具体操作如下：

取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL溶液③，混匀，标记为加标回收QC。
加标回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备（可选）

根据需要设QC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的标准品回收为例），具体操作如下：

取100 μL 溶液③加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为标准品回收QC。
标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备标准品回收QC纯化液。

四、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

取100 μL样本基质溶液（或DNA 稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为阴性质控NCS。
阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

五、无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液（即18 μL E.coli qPCR mix + 2μL E.coli Primer&probe mix）+ 20 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

六、反应体系

组分	体积（μL）
E.coli qPCR mix	18
E.coli Primer&probe mix	2
DNA template	20
总体积	40

【注】：

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液 =（反应孔数+2）× (18+2) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

2. 加样完成密封好管子后，请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下图为参考板位：

E.coli残留DNA检测试剂盒|E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

该示例是对E.coli残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：1个无模板对照NTC、5个浓度梯度的DNA标准曲线、3个样本加标回收QC（即加样回收QC）、3个待测样本、3个标准品回收QC（可选）、3个阴性质控NCS（1个即可）。建议每个样本做3个重复孔。

七、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
创建1个检测探针，命名为“E.coli-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”。
在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity” 一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“sample name”一栏中命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本孔、样本加标回收QC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“QC”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4. 扩增程序设置：设置反应体积40 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
预变性	95℃	10 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec	40

八、qPCR结果分析

1.在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出Threshold，有时系统给出的Threshold离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节Threshold 至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99；扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内；Slope在–3.4左右。

3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收QC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

HB221226

E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E.coli残留DNA含量的试剂盒。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
组分编号	组分名称	41304ES50（50T）	41304ES60（100T）
41304-A	E.coli qPCR mix	0.9 mL	1.8 mL
41304-B	E.coli Primer&probe mix	100 μL	200 μL
41304-C	DNA Dilution Buffer	2×2 mL	4×2 mL
41304-D	E.coli DNA Control（30 ng/μL）	25 μL	50 μL

【注】：本试剂盒不含ROX参比染料，若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料，推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输，-20℃保存，有效期2年。

2. 收到货后，请检查共4个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

适用机型

包含但不限于以下仪器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI Quant Studio 5；ABI Step OnePlus.

使用方法

一、E.coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2. 取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为3 ng/μL，①，②，③，④，⑤。

4. 在 ①，②，③，④，⑤ 管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
②	10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
③	10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
④	10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
⑤	10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每个浓度做3个复孔，该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于–20℃。

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天，若长时间不用，请放置于–20℃。

4. 为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

二、样本加标回收质控QC的制备

根据需要设QC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例），具体操作如下：

取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL溶液③，混匀，标记为加标回收QC。
加标回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备（可选）

根据需要设QC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL DNA量的标准品回收为例），具体操作如下：

取100 μL 溶液③加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为标准品回收QC。
标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备标准品回收QC纯化液。

四、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

取100 μL样本基质溶液（或DNA 稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为阴性质控NCS。
阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

五、无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液（即18 μL E.coli qPCR mix + 2μL E.coli Primer&probe mix）+ 20 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

六、反应体系

组分	体积（μL）
E.coli qPCR mix	18
E.coli Primer&probe mix	2
DNA template	20
总体积	40

【注】：

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液 =（反应孔数+2）× (18+2) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

下图为参考板位：

E.coli残留DNA检测试剂盒|E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

七、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
创建1个检测探针，命名为“E.coli-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“none”。
在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity” 一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“sample name”一栏中命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本孔、样本加标回收QC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“QC”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4. 扩增程序设置：设置反应体积40 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
预变性	95℃	10 min	1
变性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec	40

八、qPCR结果分析

HB221226

E.coli残留DNA检测试剂盒|E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit

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E. coli Topoisomerase IV 说明书

发表于2024年2月23日由上海金畔生物科技有限公司

世界*实验材料供应商 inspiralis 上海金畔生物为其中国代理， inspiralis 在一直是行业的*,一直为广大科研客户提供zui为的产品和服务,上海金畔生物一直秉承为中国科研客户带来的产品，的服务， inspiralis 就是为了给广大科研客户带来更加完善的产品和服务,您的满意将是我们zui大的收获

inspiralis 中国代理, inspiralis 上海代理， inspiralis 北京代理，inspiralis 广东代理， inspiralis 江苏代理inspiralis 湖北代理,inspiralis 天津,inspiralis 黑龙江代理,inspiralis 内蒙古代理,inspiralis 吉林代理,inspiralis 福建代理, inspiralis 江苏代理,inspiralis 浙江代理, inspiralis 四川代理,

inspiralis自1995以来，一直为制药行业和学术界提供抗感染、抗癌研究产品和服务。inspiralis专门供应（包括细菌拓扑异构酶旋转酶，拓扑异构酶IV，人类拓扑异构酶I和II和基板超螺旋和轻松的pBR322和kDNA）和提供拓扑异构酶抑制剂筛选试验（低和高通量），inspiralis的目标是提升研究抗感染、抗癌市场研究效率，以便更好的为客户及人类谋得福利。

E. coli Topoisomerase IV

大肠杆菌拓扑异构酶IV

Topo IV（来自 大肠杆菌）通过在大肠杆菌中过表达parC和parE亚基并通过从Peng和Marians，1999中改编的方法纯化而制备¹。

通过SDS-PAGE判断，parC和parE亚基纯化至> 95％纯度。topo IV作为稀释缓冲液中的异四聚体复合物提供。

建议将酶等分，以避免反复冻融循环。存放于-80ºC。

所有酶均提供5X浓缩的测定缓冲液和稀释缓冲液，也可单独使用。

E.coli HCP残留量ELISA检测试剂盒(E.coli HCP ELISA kit)

发表于2024年2月19日由上海金畔生物科技有限公司

E.coli HCP残留量ELISA检测试剂盒(E.coli HCP ELISA kit)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

在一些蛋白和质粒DNA生产中使用大肠杆菌进行重组表达是一种相对简单且经济有效的方式。使用了大肠杆菌进行产品生产的工艺过程中，很有可能会污染来自大肠杆菌的宿主细胞蛋白（HCPs），这种污染可能会降低治疗药物的疗效，并导致不良的毒性或免疫反应，因此在用于人类或动物的治疗类药物的生产纯化过程中，需要将该杂质含量尽可能降到最低。

ELISA法是一种使用简单、灵敏度高且客观的HCPs检测方法。本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫检测（ELISA）的实验原理进行E.coli HCP残留量检测，将E.coli HCP标准品和待测样本加入预包被抗E.coli HCP抗体的酶标板（36712-A），然后加入稀释后的生物素标记的E.coli HCP检测抗体（36712-C），最后加入Streptavidin-HRP（SA-HRP）（36712-D），形成抗体+抗原+抗体‐Biotin+ SA‐HRP 复合物，洗板后加入TMB显色液（36712-G）显色。TMB在HRP酶的催化下由无色转化成蓝色并在终止液（36712-H）的作用下最终转化成黄色。黄色的深浅与样本中被检测到的E.coli HCP的量呈正相关。本试剂盒可以用于生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

产品信息

货号	36712ES48 / 36712ES96
规格	48 T / 96 T
检测范围	3.125-200 ng/mL
检测方法	双抗夹心法
检测时长	4小时
灵敏度	2.22 ng/mL
稀释线性	80 – 120%
回收率	75 – 125%
板内差	≤ 10%
板间差	≤ 15%

实验数据

标曲数据

典型的参考标准曲线如下（以下标准曲线图仅供参考，应以同次实验标准品所绘标准曲线计算样本含量）：

E.coli HCP残留量ELISA检测试剂盒(E.coli HCP ELISA kit)

检测流程图

E.coli HCP残留量ELISA检测试剂盒(E.coli HCP ELISA kit)

图2：实验步骤流程简图

产品信息

货号	36712ES48 / 36712ES96
规格	48 T / 96 T
检测范围	3.125-200 ng/mL
检测方法	双抗夹心法
检测时长	4小时
灵敏度	2.22 ng/mL
稀释线性	80 – 120%
回收率	75 – 125%
板内差	≤ 10%
板间差	≤ 15%

实验数据

标曲数据

典型的参考标准曲线如下（以下标准曲线图仅供参考，应以同次实验标准品所绘标准曲线计算样本含量）：

E.coli HCP残留量ELISA检测试剂盒(E.coli HCP ELISA kit)

检测流程图

E.coli HCP残留量ELISA检测试剂盒(E.coli HCP ELISA kit)

图2：实验步骤流程简图

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E.coli HCP ELISA检测试剂盒(质粒)|E.coli HCP ELISA Kit(Plasmid)

发表于2024年2月19日由上海金畔生物科技有限公司

E.coli HCP ELISA检测试剂盒(质粒)|E.coli HCP ELISA Kit(Plasmid)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

重组蛋白和质粒DNA生产过程中使用大肠杆菌(E.coli)进行表达和扩增是生物制品制备中相对简单而且经济有效的方式。然而，使用大肠杆菌的工艺过程不可避免会引入宿主细胞蛋白(HCP)杂质，从而降低产品的疗效，并可能导致不良的毒性或免疫反应，因此需要保证生物制品终产品中HCP残留水平尽可能的低。

ELISA法是一种使用简单、灵敏度高且客观有效的HCP检测方法。本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫检测(ELISA)的实验原理进行质粒用E.coli HCP残留量的检测，将质粒用E.coli HCP标准品(36721-B)和待测样本加入预包被抗质粒用E.coli HCP抗体的酶标板(36721-A)，然后加入稀释后的生物素标记的质粒用E.coli HCP检测抗体(36721-C)，最后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP，即SA-HRP）(36721-D)，形成抗体+抗原+抗体–Biotin + SA–HRP复合物，洗板后加入TMB显色液(36721-H)显色。TMB在HRP酶的催化下由无色转化成蓝色并在终止液(36721-I)的作用下最终转化成黄色。黄色的深浅与样本中被检测到的E.coli HCP的量呈正相关。本试剂盒可以用于质粒相关生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

产品信息

货号	36721ES48 / 36721ES96
规格	48 T / 96 T
检测范围	3.125~200 ng/mL
检测方法	双抗夹心法
检测时长	4小时
灵敏度	1.5 ng/mL
稀释线性	80 – 120%
回收率	75 – 125%
板内差	<10%
板间差	<15%

产品性能

本试剂盒性能经过充分评估，具体可联系翌圣技术人员获得相应的性能验证报告。

本试剂盒性能经过充分评估，标曲范围为 3.125~200 ng/mL，板内精密度小于 10%，板间精密度小于 15%，准确度满足75%~125%范围，检测限为 1.5 ng/mL。

注意事项

1）使用本试剂盒前请仔细阅读本说明书；

2）请在有效期内使用该产品，禁止不同批次的相关试剂进行混用；

3）所有试剂在使用之前，均需要恢复至室温；

4）本产品仅能够应用于检测说明书中标注的靶点抗原与样本。其它应用需经使用者设计验证后，根据结果评估使用的可靠性与准确性；

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；

6）本产品仅用作科研用途。

Ver.CN20231031

产品信息

货号	36721ES48 / 36721ES96
规格	48 T / 96 T
检测范围	3.125~200 ng/mL
检测方法	双抗夹心法
检测时长	4小时
灵敏度	1.5 ng/mL
稀释线性	80 – 120%
回收率	75 – 125%
板内差	<10%
板间差	<15%

产品性能

本试剂盒性能经过充分评估，具体可联系翌圣技术人员获得相应的性能验证报告。

本试剂盒性能经过充分评估，标曲范围为 3.125~200 ng/mL，板内精密度小于 10%，板间精密度小于 15%，准确度满足75%~125%范围，检测限为 1.5 ng/mL。

注意事项

1）使用本试剂盒前请仔细阅读本说明书；

2）请在有效期内使用该产品，禁止不同批次的相关试剂进行混用；

3）所有试剂在使用之前，均需要恢复至室温；

4）本产品仅能够应用于检测说明书中标注的靶点抗原与样本。其它应用需经使用者设计验证后，根据结果评估使用的可靠性与准确性；

5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；

6）本产品仅用作科研用途。

Ver.CN20231031

E.coli HCP ELISA检测试剂盒(质粒)|E.coli HCP ELISA Kit(Plasmid)

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货号	品名	规格	价格	品牌
T4001	E. coli Topoisomerase IV	0.01 ml	2717	inspiralis
T4002	E. coli Topoisomerase IV	0.05 ml	10162	inspiralis
T4003	E. coli Topoisomerase IV	0.1 ml	20282	inspiralis
T4004	E. coli Topoisomerase IV	0.2 ml	38211	inspiralis

日本Sanplatec官网代理商

三博特日本ATTO电泳槽日本东洋advantec滤纸中国代理商

标签归档：coli

E.coli DNA ligase DNA连接酶　NGS甲基化建库DNA连接酶

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大肠杆菌拓扑异构酶IV

E.coli HCP残留量ELISA检测试剂盒(E.coli HCP ELISA kit)

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E.coli HCP ELISA检测试剂盒(质粒)|E.coli HCP ELISA Kit(Plasmid)

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