Jinpan品牌PEI转染试剂

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Jinpan品牌线性PEI转染试剂说明书

Jinpan品牌

PEI转染注意要点 

化学名：线性聚乙烯亚胺，线性PEI，聚乙烯亚胺，线性，MW 25000，转染级

订货号＃：  9002-98-6   规格：1G  品牌：Jinpan       CAS＃：  9002-98-6,26913-06-4        

分子式：（CH2CH2NH）n      分子量： 25,000      熔点： 73-75º 

溶于：热水，低pH冷水，甲醇和乙醇。    不溶于：苯，乙酉迷和丙酮   

外观：白色至黄色固体       处理：手套和通风橱

储存：在室温下避光干燥储存

配置：1：称取100mg线性聚乙烯亚胺，加新鲜的细胞级别的水90ml，加盐酸至PH=3左右， 加热至80℃左右搅拌过夜溶解PEI，

2：用氢氧化钠溶液调整pH值至7.0 ，定容至100ml，用0.22um的滤器过滤，分装后储存于4℃，保质期可以达到12个月。

转染操作流程：

◆ 瞬时转染方法  1. 接种细胞： 转染前一天，用胶原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化细胞并计数（不建议用胰酶）。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物： DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液 的试管，一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如 NEST  5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞： 直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后，添加½体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果： 在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后快 7 h 即可检测到转入基因的表达。 请自行确定适合检测时间。

◆稳定转染方法

1. 接种细胞： 转染前一天，用胶原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化细胞并计数（不建议用胰酶）。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物： DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据表 1 所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 线性PEI转染试剂(这个需要客户自行摸索配比，每一批转染试剂和每一批DNA比例可能会稍有不同）。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管，一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如 NEST  5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞： 直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后，添加½体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果： 在 CO2培养箱中 37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后 7 h 即可检测到转入基因的表达。

5.转染 24 h 后，将细胞传代至新鲜的生长培养基中（将细胞稀释 10 倍 以上），在 CO2培养箱中 37℃孵育过夜。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约 1~2 周可 筛选到耐药性克隆，在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。 „

上海金畔生物自产线性PEI转染试剂特别提醒

1. PEI 25K含有4-11％的残留丙酰基，这可能阻碍聚合物主链与DNA的有效结合，所以批间转染效率可能会有比较大的差异，建议一个批次可以多购买，PEI 25K稳定性在室温干燥避光下可稳定保存10年以上（虽然有效期标注只有18个月左右）

2. 对于某些类型的细胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 细胞，在转染前两天铺板可显著 提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板，可适当降低铺板密度，以确保转染时细胞的汇合度仍为 70~80%。

3. 对于接触抑制敏感的细胞，可适当降低铺板密度。

4. 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情况下，DNA-PEI复合物仍能转染细胞，但是 DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。我们推荐使用 Opti-MEM ITM 培养基以达到宜转染效率。其他的无蛋白培养基则需测试与线性PEI转染试剂的兼容性。

5. 对大多数细胞来而言，每 1 μg DNA 使用 3.0 μL PEI转染试剂都能获得较高转染效率。使用 者也可尝试每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 体积线性PEI转染试剂进行优化。

6.本手册只是一个基本操作手册，具体转染过程中需要根据实验进行优化，优化方向为混合时间，转染时间，DNA混合比列…….

7.Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) 为Polysciences公司生产的化合物产品，每批产品出厂前都经过严格的检测,保证每批产品都*、稳定且高品质,但由于作为转染试剂使用过程中有很多实验室因素(配置方法，PH,水纯度,称量的准度,dna RNA纯度,细胞状态，细胞品系…)造成溶解出现问题或者转染效率出现差异,所以厂家只受理该产品纯度，分子量及重量缺失破损等相关投诉，针对极个别客户溶解问题和转染效率问题我们只能友善解决,所以不能保证您能获得满意答复，对于产品产品转染效率不高，转染批间有差异，转染不了等问题，不作为评价我们售后工作的依据。
    如果我们提供的PEI手册都无法解答您的问题,建议您可以多看文献,多调整一下转染条件,找出适合自己细胞的转染方法。如果无暇摸索条件,您也可以直接购买我们配置好细胞转染液,这样免去您很多烦恼,谢谢理解

8.部分数据参考，本数据来源于网络，不作为售后投诉依据

上海金畔生物自产线性PEI转染试剂转染试剂和DNA配比数据

转染效率

上海金畔生物自产线性PEI转染试剂价格表

PEI转染的方法

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（*转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

PEI转染的方法
材料：质粒DNA  指数生长的真核细胞    PEI （聚乙烯亚胺，是线性的）  1×HBS （pH7.4）
配方：  PEI 储存液（100 μM）：称取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS （pH7.4）
中， 0.2 μm 滤膜过滤，储存于4℃备用。
1×HBS （pH7.4）： 将8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超纯水，加入20 ml 1 M 的
HEPES，调pH 值到7.4，定容至1 L，过滤（0.2 μm 滤膜）后储存于4℃备用。
方法：
1．细胞分盘： 通过胰酶消化收集细胞，用适当的*培养基以4×105 至8×105
细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，
使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90％）。根据细胞贴壁情况于
含5％ CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁*后即可开始转染。转染
前换入2 mL 预热的无血清培养基。
2. 制备PEI-DNA 混合物：以60 mm 组织培养皿用420 μL 反应总体积为例。准
备两支1.5 mL 离心管，一管将质粒DNA（总量2-8 μg 为佳）加入240 μL HBS
中，混匀。另一管中则用HBS 将100 μM 的PEI 储存液稀释成10 μM，充分
混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中，充分混匀后
室温静置20-30 min。zui后将这420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述单层
细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％～7％ CO2 的37℃ 温箱
孵育。
注：每次用100 μM 的PEI 储存液前都需要先将其充分混匀，保证所取的
浓度一致。
3. 培养6-10 h 后更换为37℃预热的含有血清的培养基，继续培养，16 h 左右
可以观测到报告基因的表达。

订货信息

                                         PEI转染手册

转染操作流程：
 
  1、细胞传代：

转染前24h内分离293T细胞至含10％胎牛血清的DMEM培养基 中进行传代培养，接种密度如下：
         6孔板：0.5×10⁶细胞
         10cm培养皿：4.0×106细胞
         15cm培养皿：9.0×106细胞

2、转染

转染前将所有试剂置于室温。

2.1质粒DNA的稀释

在无菌试管中，用无血清的DMEM W / O酚红培养基（浓度为10％）稀释质粒DNA（ug）。病毒包装体（psPAX2）：病毒包膜（pMD2G）和重组质粒DNA的稀释比例分别为4:2:1。
       

6孔板：200ul+3ug的DNA
        10cm培养皿：1ml+7-8ug的DNA
        15cm培养皿：2ml+11-12ug的DNA

   2.2 转染复合体形成

将PEI（1ug/uL）加入已稀释的总DNA中，PEI与DNA（ug）的混合比率为3:1。加入后立即涡旋混合。
      

 6孔板：9ul PEI复合体（1ug/ul）=9ug
        10cm培养皿：21ul PEI复合体（1ug/ul）=21ug
        15cm培养皿：33ul PEI复合体（1ug/ul）=33ug
将添加到细胞的DNA/ PEI的混合物在室温下孵育15分钟。

4、收获转染细胞

转染后48小时内收获转染细胞/或病毒上清。
 
试剂的配制：
PEI（1ug/ul）
1、将无内毒素的无菌水加热至80℃左右溶解PEI，冷却到室温。
2、调整pH值至7.0，用0.22um的滤器过滤消毒，分装后储存在-20℃。工作液可保持在4℃

订货信息

友情提醒： BIOHIB的线性聚乙烯亚胺78pei25000
可完美替代 Polysciences公司货号为 23966-1Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)的产品  BIOHIB的线性聚乙烯亚胺78pei40000
可完美替代 Polysciences公司货号为 24765-1 Polyethylenimine, Linear (MW 40,000)的产品

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