HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性（可耐受最高0.3 MPa的压力），该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。
产品性质
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基质（Matrix）
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高度交联的6%琼脂糖凝胶
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粒径（Bead size）
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45-165 µm
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载量（Capacity）
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＞40 mg 6×His-tagged protein/mL基质
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耐压（Tolerance Pressuremax）
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0.3 MPa，3 bar
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储存缓冲液（Buffer）
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含20%乙醇的1×PBS
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运输和保存方法
冰袋运输。4℃保存。有效期2年。
注意事项
1) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）本产品仅作科研用途！
使用方法
一、纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3。
2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1 mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1 mg/mL。
注：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液至离心管中，10000 rpm，4℃离心20-30 min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000 rpm离心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
注：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000 rpm，4℃离心20-30 min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
3 装柱
1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去离子水。
2）将树脂悬浮，小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4）打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用所用泵的最大流速，这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。注：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%。
5）关闭泵，关闭层析柱出口。
6）如使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如需要可重新调整分配器。
4 样品纯化
装柱后，可用各种常规的中压色谱系统，以AKTA使用为例进行说明：
1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
2）3-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。
3）至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1 mL/min，5 mL预装柱推荐流速为5 mL/min。
4）利用泵或注射器上样，收集流出液，以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。
注：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
注：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7）建议用更高浓度咪唑（如500 mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。
5 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。
二、在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（>0.5 Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸溶液，接触时间为1-2 h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。
2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。
三、填料再生
当填料使用过程中发现反压过高（>0.5 Mpa），填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：
1）使用5倍柱体积去离子水清洗填料；
2）使用5倍柱体积100mM EDTA（pH 8.0）剥落镍离子；
3）使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积，停留10-15min；
5）使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
6）使用3-5倍柱体积100mM NiSO4再生挂镍；
7）去离子水清洗10倍柱体积。
填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。
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附表1 HisSep Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况
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试剂种类
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浓度
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还原剂
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5 mM DTE
0.5-1 mM DTT
20 mM β-mercaptoethanol
5 mM TCEP
10 mM reduced glutathione
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变性剂
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8 M urea
6 M Gua-HCl
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去污剂
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2% TritonTM X-100，nonionic
2% TweenTM20，nonionic
2% NP-40，nonionic
2% Cholate，anionic
1% CHAPS，zwitterionic
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其他类
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500 mM imidazole
20% ethanol
50% glycerol
100 mM Na2SO4
1.5 M NaCl
1 mM EDTA
60 mM citrate
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缓冲液
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50 mM sodium phosphate，pH7.4
100 mM Tris-HCl，pH7.4
100 mM Tris-acetate，pH7.4
100 mM HEPJP，pH7.4
100 mM MOPS，pH7.4
100 mM sodium acetate，pH7.4
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缓冲液名称
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配方
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配制1L溶液所需各种试剂量
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Lysis Buffer，pH8.0
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50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM imidazole
NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌
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NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g
NaCl 17.54 g
Imidazole 0.68 g
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Wash Buffer，pH8.0
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50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
20 mM imidazole
NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌
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NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g
NaCl 17.54 g
Imidazole 1.36 g
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Elution Buffer，pH8.0
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50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
250 mM imidazole
NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌
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NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g
NaCl 17.54 g
Imidazole 17.0 g
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附表2 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
附表3 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
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缓冲液名称
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配方
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配制1L溶液所需各种试剂量
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Lysis Buffer，pH8.0
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8 M Urea
100 mM NaH2PO4
100 mM Tris·HCl
盐酸溶液调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌
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Urea 480.5 g
NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g
Tris 15.76 g
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Wash Buffer，pH6.3
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8 M Urea
100 mM NaH2PO4
100 mM Tris·HCl
盐酸溶液调pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌
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Urea 480.5 g
NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g
Tris 15.76 g
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Elution Buffer，pH4.5
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8 M Urea
100 mM NaH2PO4
100 mM Tris·HCl
盐酸溶液调pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌
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Urea 480.5 g
NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g
Tris 15.76 g
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附表4 问题及解决方案
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问题
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可能原因
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推荐解决方案
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柱子反压过高
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填料被堵塞
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裂解液中可能含微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22 µm或0.45 µm）过滤，或离心去除。
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样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI （终浓度为5 µg/mL），Mg2+(终浓度1 mM)，冰上孵育10-15 min
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样品太黏稠
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有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。
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洗脱组分中无目的蛋白
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蛋白可能是包涵体
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可通过电泳检测裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式
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表达量太低
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优化表达条件，使用包涵体纯化缓冲体系
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目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤中已被洗下来
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提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑浓度
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目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来
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降低Elution Buffer 的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度
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使用10-100 mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到蛋白
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蛋白降解
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菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂
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在4℃下进行纯化操作
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洗脱组分不纯（含多种蛋白）
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洗杂不彻底
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增加Wash Buffer 体积
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样品中含有其他His标签蛋白
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通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段（如去离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。
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填料颜色变浅或变成白色
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镍离子脱落或者剥离
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按照填料再生的操作重新挂镍离子
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填料呈现褐色
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缓冲液中含有DTT等还原剂
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参考附3适当降低还原剂DTT的浓度，或改用巯基乙醇
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上样过程中蛋白发生沉淀
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操作温度太低
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室温下进行上样
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蛋白发生聚集
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在样品和所有缓冲液中添加稳定剂，如0.1%Triton X-100或Tween-20
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