牛痘病毒加帽酶 mRNA加帽反应|Vaccinia Capping Enzyme
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产品描述
真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构,即帽子结构,该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶,其由D1和D12两个亚基组成,兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性,可将7-甲基鸟嘌呤帽结构(m7Gppp)连接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。牛痘病毒加帽酶,在合适浓度的加帽缓冲液(Capping buffer),鸟苷三磷酸(GTP),S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等存在条件下,能够在一个小时之内对RNA进行加帽,并且保证正确的方向。
本品以无菌液体形式提供,可应用于体内/体外翻译前mRNA的加帽反应或mRNA的5'末端标记反应。
产品性质
来源(Source) |
携带牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
最适温度(Optimum Temperature) |
37℃ |
储存缓冲液(Storage Buffer) |
20mM Tris-HCl pH 8.0,100 mM NaCl,1 mM DTT,0.1 mM EDTA,0.1% Triton X-100,50%甘油 |
活性单位定义(Unit Definition) |
37℃条件下,1小时内将10 pmol GTP(α- 32P)掺入到一条含80个核苷酸(80nt)转录产物上所需要的酶量,即为1个单位。 |
产品组分
组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
||
10615ES76 (500 U) |
10615ES84 (2000 U) |
10615ES92 (10000 U) |
||
10615-A |
10×Capping Buffer |
150 μL |
500 μL |
1.25 mL×2 |
10615-B |
Vaccinia Capping Enzyme(10 U/μL) |
50 μL |
200 μL |
1 mL |
运输和保存方法
干冰运输。 -15℃ ~ -25℃保存,有效期一年。推荐分装保存,避免反复冻融。
使用方法
加帽反应(反应体系20 μL)
本步骤适用于10μg RNA(≥ 100 nt)的加帽反应,且可根据实验需要放大。
1. 取10μg RNA至1.5 mL离心管,使用无核酸酶的水稀释至9.5 μL;
2. 65℃加热5 min;
3. 取出离心管置于冰上5 min;
4. 依次加入以下组分:
组分 |
体积 |
Denatured RNA |
9.5 μL |
10×Capping Buffer |
2.0 μL |
Murine RNase inhibitor(40 U/μL) |
0.5 μL |
GTP (10 mM) |
1.0 μL |
SAM (10 mM, fresh) |
1.0 μL |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) |
5.0 μL |
Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U/μL) |
1.0 μL |
【注】:10×Capping Buffer(Cat# 10666):0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT pH 8.0 @ 25°C。
5. 37°C孵育2 h;
6. RNA加帽完成,可进行后续实验。
注意事项
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;
2. 所提取的RNA需经过纯化并使用无核酸酶的水重悬;
3. 在加入酶之前需要对RNA溶液进行加热以去除5'末端的二级结构;
4. 对于已知5'末端结构的RNA,可以延长反应时间至4 h,提高加帽效率;
5. 5'末端标记反应体系中,GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1-3倍。
HB220701
产品描述
真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构,即帽子结构,该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶,其由D1和D12两个亚基组成,兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性,可将7-甲基鸟嘌呤帽结构(m7Gppp)连接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。牛痘病毒加帽酶,在合适浓度的加帽缓冲液(Capping buffer),鸟苷三磷酸(GTP),S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等存在条件下,能够在一个小时之内对RNA进行加帽,并且保证正确的方向。
本品以无菌液体形式提供,可应用于体内/体外翻译前mRNA的加帽反应或mRNA的5'末端标记反应。
产品性质
来源(Source) |
携带牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
最适温度(Optimum Temperature) |
37℃ |
储存缓冲液(Storage Buffer) |
20mM Tris-HCl pH 8.0,100 mM NaCl,1 mM DTT,0.1 mM EDTA,0.1% Triton X-100,50%甘油 |
活性单位定义(Unit Definition) |
37℃条件下,1小时内将10 pmol GTP(α- 32P)掺入到一条含80个核苷酸(80nt)转录产物上所需要的酶量,即为1个单位。 |
产品组分
组分编号 |
组分名称 |
产品编号/规格 |
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10615ES76 (500 U) |
10615ES84 (2000 U) |
10615ES92 (10000 U) |
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10615-A |
10×Capping Buffer |
150 μL |
500 μL |
1.25 mL×2 |
10615-B |
Vaccinia Capping Enzyme(10 U/μL) |
50 μL |
200 μL |
1 mL |
运输和保存方法
干冰运输。 -15℃ ~ -25℃保存,有效期一年。推荐分装保存,避免反复冻融。
使用方法
加帽反应(反应体系20 μL)
本步骤适用于10μg RNA(≥ 100 nt)的加帽反应,且可根据实验需要放大。
1. 取10μg RNA至1.5 mL离心管,使用无核酸酶的水稀释至9.5 μL;
2. 65℃加热5 min;
3. 取出离心管置于冰上5 min;
4. 依次加入以下组分:
组分 |
体积 |
Denatured RNA |
9.5 μL |
10×Capping Buffer |
2.0 μL |
Murine RNase inhibitor(40 U/μL) |
0.5 μL |
GTP (10 mM) |
1.0 μL |
SAM (10 mM, fresh) |
1.0 μL |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) |
5.0 μL |
Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U/μL) |
1.0 μL |
【注】:10×Capping Buffer(Cat# 10666):0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT pH 8.0 @ 25°C。
5. 37°C孵育2 h;
6. RNA加帽完成,可进行后续实验。
注意事项
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;
2. 所提取的RNA需经过纯化并使用无核酸酶的水重悬;
3. 在加入酶之前需要对RNA溶液进行加热以去除5'末端的二级结构;
4. 对于已知5'末端结构的RNA,可以延长反应时间至4 h,提高加帽效率;
5. 5'末端标记反应体系中,GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1-3倍。
HB220701
Q: 酶法加帽中先升温再降温的目的是什么?在放大生产时好像很难做到先升温再降温。
A: 先升温是为了把RNA二级结构打开,让RNA处于单链状态。如果不进行这步操作的话,会影响加帽的效率。这部分目前的确是工艺生产上的难点。现在有的公司直接在模板序列确定时会对RNA的二级结构作预测,加帽酶只识别mRNA前几个核苷酸,如果确定这部分结构不会产生RNA的二级结构的话,可以不进行加热。
Q: 帽类似物加帽和酶法加帽如何选择?
A: 工业上酶法加帽最常使用的是牛痘病毒加帽酶处理IVT产物可以将其修饰成Cap 0 mRNA,Cap 0结构可以在二氧甲基转移酶(2'O-methyltransferase)的作用下进一步修饰成Cap 1(m7GpppmN)。利用酶法加帽,加帽效率可以达到95%以上。共转录加帽法操作简便,但由于GTP会竞争帽状二聚体,因此该方法加帽率低一些;两种方式各有优缺点。
Q: 加帽优化的方式有哪些?
A: 通过增加VCE的量例如100ul体系加入10ul即100U的酶活,主要是增强VCE的甲基转移酶活性,也可以通过增加SAM(0.5mmol)增强鸟苷转移活性,增加加帽率。例如我们的新款单链加帽酶,它的加帽率显著提升,就是鸟苷转移活性比传统的更好,对于传统VCE,小亚基D12容易沉淀形成聚合物,纯化时容易损失,所以成本更贵,批次不能控制。
Q: 对于一些没有加上帽子的mRNA,会对后续实验比如说做生物制剂等有什么影响?
A: 目前行业对这一块的没有做针对性的去除,行业里面主要是看加帽效率的多少,目前做的比较好的加帽率在80%以上,当然肯定是越高越好了。这个还没有一个绝对的标准。
对于合成之后的mRNA,可以用纯化的方式处理,比如康*的一步膜包,极大的减少了纯化工艺,传统用Oligo d(T)的柱子做纯化,效果好可以回收率70-80%;效果差40-50%,也可以多加一步疏水柱在oligo dT后。
Q: 共转录加帽和两步法加帽对于模板的起始位点的要求?
A: 共转录要求对于模板的起始位点要求必须是 AGG* 开头
两步法对于位点无要求,但我司目前产品对于AGGG起始位点的产量最高,主要是T7酶的偏好性导致。
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