tncbio XerumFree操作说明书

XerumFree易于使用：

只需像使用FBS（通常为10%）一样将XerumFree添加到培养基中即可。要从含FBS的培养基转变为含XerumFree的培养基，我们建议按照使用手册（可根据要求提供，或从我们的网站下载）中所述的步骤进行细胞断奶

在无干燥浓缩培养基上成功培养的细胞示例：

•肝上皮细胞•HaCaT

•原代人肝细胞•杂交瘤

•维罗•HEK293

•CHO•HEP G2

•HeLa•等。

•人类角质形成细胞

 

Catalog number      Volume                  Product

XF212-0100           100 ml                    XerumFree

XF212-0500           500 ml                    XerumFree

XF212-xxxx           on request / customized XerumFree

defined cellculture

XerumFree™ XF212 Medium Supplement.

完整定义、无动物成分的细胞培养补充剂。

在没有血清的情况下进行细胞培养可能很有挑战性。然而，这些回报在很大程度上是对这些努力的回报，重新发现细胞培养的基础很快发展成为一种激情。本文的目的是引导用户顺利过渡到无血清状态，并避免所有不充分或不适当的努力。

理想情况下，向无血清条件的转化应进行多次传代，以逐渐选择可在无血清条件下生长的细胞。然而，如果所有关键方面都得到适当解决，直接适应无血清环境也可能成功。

无论采用何种方法，关键问题包括细胞接种物的生长状态、细胞接种密度、亚培养技术和细胞培养系统的生物物理属性。

TNCbio的XerumFree™ 血清替代物的设计目的是以与传统细胞培养血清相同的方式使用，作为培养基补充。

使用浓缩防静电剂前的重要注意事项™ XF212：

-XF212是一种替代血清的细胞培养基添加剂，

 

tncbio XerumFree培养细胞说明书

 

XerumFree 是一种*定义的添加剂，无需血清，适用于各种细胞培养实践。由于 XerumFree 是化学定义的，它避免了批次间的差异。XerumFree 中的所有成分都是经过高度纯化和鉴定的化合物。

XerumFree的优势与传统的 FBS 富集培养基相比，在 XerumFree 富集培养基中培养细胞具有许多优势。

• 由于其化学性质，不存在批次间差异。这跳过了测试新批次血清的需要。

• 在您的研究中没有未知血清化合物的干扰

• 由于它不含激素或细胞因子，因此不会影响您的研究数据

• XerumFree 在使用中保存，因为它不包含动物或人类衍生材料

• 它可以存放在冰箱里。使用前无需解冻。        
  

不含动物和人类衍生 化合物 /* ACF。

在过去的几十年中，由于病毒和朊病毒污染的风险以及对可追溯性记录的需求，放弃使用 FBS 的监管压力变得越来越大。TNCBio 通过展示 XerumFree™（一种高效且*定义的细胞培养补充剂）来支持对 FBS *不含动物成分的替代品的需求。

XerumFree™ 的成分保证不含任何源自动物或人类材料的产品。XerumFree™ 具有超低的蛋白质含量。

XerumFree™ 中的蛋白质仅来自重组来源，这些蛋白质是  通过 ACF 培养基中的重组细菌过程产生的。

 

*定义是确保每批产品质量相同的*佳方式。

 

市场上作为 FBS 替代品提供的许多产品是含有水解产物、植物提取物和/或动物或人类蛋白质（如白蛋白）的组合物。这会以负面的方式影响批次之间的一致性，降低对培养环境的控制，并使进一步合理的优化步骤难以执行。  XerumFree™ 仅包含来自 合成或重组 来源的高度纯化的化学物质。这保证了批次之间的一致性和完整的可追溯性记录。您可以肯定，您今天在研发或生产中使用的 XerumFree™ 与您将来短期和长期使用的 XerumFree™ *相同。

可靠性

在供应、成本和质量方面，您无法承受可能导致疫苗生产出现缺口的意外情况。XerumFree™ 质量的一致性由*定义和* ACF的事实保证 。此外，供应链中断的风险几乎为零，因为 TNCBio 还注意向您的生产设施供应 XerumFree™ 的一致性。TNCBio 的 制造设施已为大批量生产做好准备，并可根据需要灵活扩大规模。用于生产 XerumFree™ 的原材料对世界市场的波动、波动和可用性不敏感。  这保证了 XerumFree™ 的持续生产和供应给 TNCBio 的客户，我们也可以以固定价格签订合同。

表现

生产中的每一次变化都需要增加产量，无论是质量方面还是数量方面，或两者兼而有之。除了为您的工艺带来稳定和安全质量的特性外，XerumFree™ 已 在生产 环境中证明，与 FBS 或其他未定义培养基相比，细胞产量可比或更高。

灵活性

用于研发的 XerumFree™ 标准包装为 100 和 500 毫升 Nalgene PETG 瓶。对于产量较高的生产目的，我们几乎可以提供您可能需要的所有包装。无论是袋子还是容器；只要我们能找到它们，我们就可以交付。

 

XerumFree™用于最佳无血清细胞培养的*定义的添加剂。

XerumFree™ 被开发用于添加到基础细胞培养基中以替代胎牛血清。它*不含动物和人类衍生的化合物。

当质量和一致性很重要时，XerumFree™ 是一个好的选择。

tncbio XerumFree说明书

XerumFree易于使用：

只需像使用FBS（通常为10%）一样将XerumFree添加到培养基中即可。要从含FBS的培养基转变为含XerumFree的培养基，我们建议按照使用手册（可根据要求提供，或从我们的网站下载）中所述的步骤进行细胞断奶

在无干燥浓缩培养基上成功培养的细胞示例：

•肝上皮细胞•HaCaT

•原代人肝细胞•杂交瘤

•维罗•HEK293

•CHO•HEP G2

•HeLa•等。

•人类角质形成细胞

 

Catalog number      Volume                  Product

XF212-0100           100 ml                    XerumFree

XF212-0500           500 ml                    XerumFree

XF212-xxxx           on request / customized XerumFree

defined cellculture

XerumFree™ XF212 Medium Supplement.

完整定义、无动物成分的细胞培养补充剂。

在没有血清的情况下进行细胞培养可能很有挑战性。然而，这些回报在很大程度上是对这些努力的回报，重新发现细胞培养的基础很快发展成为一种激情。本文的目的是引导用户顺利过渡到无血清状态，并避免所有不充分或不适当的努力。

理想情况下，向无血清条件的转化应进行多次传代，以逐渐选择可在无血清条件下生长的细胞。然而，如果所有关键方面都得到适当解决，直接适应无血清环境也可能成功。

无论采用何种方法，关键问题包括细胞接种物的生长状态、细胞接种密度、亚培养技术和细胞培养系统的生物物理属性。

TNCbio的XerumFree™ 血清替代物的设计目的是以与传统细胞培养血清相同的方式使用，作为培养基补充。

使用浓缩防静电剂前的重要注意事项™ XF212：

-XF212是一种替代血清的细胞培养基添加剂，因此它不是

最后一道菜。

-XF212必须添加到基础细胞培养基中（例如IMDM、DMEM-F12或任何其他选择的基础培养基）。

-XF212不含细胞因子、激素等生长因子。

因此也没有胰岛素*。

 

内容：

1准备

1.1细胞培养基的一般制备

1.2无血清条件下的一般适应方法

1.2.1直接适应

1.2.2顺序适应

2使用XF212

2.1细胞系

2.1.1锚定依赖性细胞系

2.1.2非锚定细胞系

 

1. 准备XF212

   1.1无血清细胞的一般制备

   培养基

   轻轻摇动免静电瓶™ 使用前不久。

   添加XerumFree™ 与血清浓度相同的基础培养基（例如10%）。

   在这个阶段不要添加任何抗生素。事实上，抗生素和许多化合物一样，与血清的血浆蛋白结合，尤其是与白蛋白部分结合。

   因此，在无血清和无白蛋白的条件下，相同浓度的抗生素将表现出更高的生物活性，这种活性的增加可能会对细胞生长产生有害影响。

   如果认为“无抗生素培养”不可行，建议使用浓度为50 mg/l的庆大霉素。

   *一些用户更喜欢或需要在没有胰岛素的情况下培养细胞。如果是无静电的™ 是否使用胰岛素（和/或其他生长因子）培养细胞的决定权在你。如果细胞生长和性能需要胰岛素，我们建议在1.25 mg/l的最终细胞培养基中添加重组胰岛素。

    

1.2无血清条件下的一般适应方法

基本上有两种方法可以使细胞适应无血清环境中的生长：

1.2.1直接适应

这是通过将细胞从含血清培养基直接转移到无血清培养基来实现的。

1.2.2顺序适应或断奶方法将细胞从含有原始血清的培养基中依次通过以下阶段，其中每个步骤将添加血清的培养基减半，从而将无血清培养基增加至大约低于以下值：

第一阶段：

50%无干补充培养基/50%血清补充培养基

第二阶段：

75%无干燥补充培养基/25%血清补充培养基

第三阶段：

87.5%无干补充培养基/12.5%血清补充培养基

第四阶段：

93.75%无干补充培养基/6.25%血清补充培养基

第五阶段：

96.88%无干补充培养基/3.12%血清补充培养基

第6阶段：

98.44%无干补充培养基/1.56%血清补充培养基

第7阶段：

无干燥补充培养基

如果增长率下降，后退一步，在再次增长后继续。

细胞培养可能包括细胞系（贴壁或悬浮生长）或原代培养。此外，从功能的角度来看，细胞类型可能会发生不同程度的分化，或者表现出未分化的特征，比如干细胞制剂。

在每种情况下，适应协议都必须考虑到细胞类型的特定要求，以确保获得最佳成功机会。

 

2.XF212的使用

2.1细胞系

以下协议适用于正常（二倍体，有限寿命）或转化或永生化细胞系（生命周期不确定）。

2.1.1锚定依赖性细胞系

关键成功因素：

-细胞培养载体的涂层可实现最佳细胞附着

-尽量减少胰蛋白酶的作用

-抗生素系统的选择

实验步骤：

A） 使用以下方法在细胞培养表面涂抹足够的细胞附着因子：

-一种商用涂层试剂盒，如Pronectin™ F、 MapTRIX™ 或同等标准。

-纤维连接蛋白或聚赖氨酸涂层，或

-少量FBS（例如，T25烧瓶为500μl），在37°C下培养过夜，然后用PBS或新鲜培养基洗涤两次。

-即用塑料可改善粘附细胞的附着。

B） 分离细胞单层

-在缺乏含有胰蛋白酶抑制剂的血清的情况下，标准胰蛋白酶制剂的使用可能会出现一些问题。它是

因此，在无血清条件下尽可能降低残余胰蛋白酶的蛋白水解活性，以避免对细胞造成不可逆的损伤是非常重要的。

这可以通过使用胰蛋白酶抑制剂（例如来自大豆）或使用非哺乳动物解离试剂（例如

Accutase™ 在传代过程中不需要灭活或去除。或者，细胞颗粒的额外洗涤步骤将去除大部分剩余的胰蛋白酶。然而，这个过程意味着额外的离心步骤，可能会对某些细胞类型造成损害。

-我们的偏好是：*忘记胰蛋白酶，使用Accutase™ 还是脱附™ 分离细胞单层；这些细胞分离解决方案

能够满足贴壁细胞温和有效分离的苛刻

要求；细胞膜和表面表位不会受到损害，细胞的结构和功能质量也不会受到影响

 

表面蛋白质保持完整。

C） 每平方厘米20000个细胞的种子细胞

在根据第1点制备的完整培养基中。

-在试验的第一步，观察高播种密度是很重要的

适应过程。细胞通常分泌一系列因子

进入控制细胞附着、生长和增殖的培养基。然而，在播种阶段，这些因素在土壤中是不存在的

新鲜无血清培养基和临界水平的细胞密度对于诱导这些自分泌/旁分泌因子的立即充分产生至关重要。

D） 在37°C下培养并保持细胞培养物，直到它们达到80-90%的融合率。

-在此期间，每2-3天更换75%的培养基。不要丢弃用过的培养基。

取而代之的是收集条件培养基、无菌过滤器，并在4°C下放置，以便在接下来的步骤中使用。如果细胞在任何时候似乎停滞了，让它们有更多的时间适应新的无血清环境。

E） 当达到接近融合时，以1:2或1:3的比例分裂细胞。

-这是XerumFree中的第二段™ 不需要涂层，但强烈建议使用条件培养基-该培养基部分确实包含调节附着、扩散、生长和生长的自分泌因子

激增在前一代收集的由75%新鲜培养基+25%条件培养基组成的混合物中的种子细胞。

继续每2-3天向细胞提供75%的新鲜培养基，并按照上述d）收集条件培养基。

F） 重复步骤E），直到细胞表现出与之前在补充血清的培养基中的生长相当的生长动力学。

-在这一点上，细胞系可以被认为是*适应的。这可能总共需要4-6段。

G） 从这一点开始，抗生素可以添加到培养基中。

-我们建议使用广谱抗生素庆大霉素；与标准抗生素相比，这种抗生素的细胞毒性大大降低

青霉素/链霉素鸡尾酒。庆大霉素的建议使用浓度为50 mg/l。

H） 一旦调整，可以应用原始分割比率（在补充血清的条件下）。

 

2.1.2非锚定细胞系

以下方案适用于已经悬浮生长的细胞系。用于贴壁细胞对无干细胞的适应™ 悬浮生长，请参阅TNC BIO的技术说明“细胞从单层到无血清悬浮培养的适应性”。

关键成功因素：

抗生素系统的选择

实验步骤

A） 当细胞密度达到3-5 x 106个细胞/毫升（取决于细胞系）时，开始切换到无干燥状态™ 补充中等。

收获细胞悬浮液，取出一小份进行细胞计数，并以200 g离心整个悬浮液5分钟。

B） 进行细胞计数。

C） 将细胞颗粒重新放置在无干燥的环境中™ 以106个细胞/毫升的密度补充培养基。

在适应过程的最初阶段，观察高播种密度很重要。

细胞通常会向培养基中分泌一系列因子来控制细胞的生长和增殖。然而，在播种阶段，这些因素在新鲜无血清培养基中不存在，细胞密度的临界水平是

对于诱导这些自分泌/旁分泌因子的立即充分产生至关重要。

D） 在37°C下培养并保持细胞培养物，直到其密度达到约3-5 x 106个细胞/毫升。

E） 以1:3或1:4的比例拆分悬浮培养物，方法是添加适当体积的新鲜培养基（例如，25毫升细胞悬浮液+75毫升无水培养基）™ 补充培养基，放入4个单独的培养基中

船只）

F） 重复步骤E）直到培养物显示出最初在补充血清的培养基中的生长动力学。从那时起，细胞系可以考虑

*适应，并可在补充血清培养期间按原始比例拆分。

G） 从这一点开始，抗生素可以添加到培养基中。

我们建议使用浓度为50毫克/升的庆大霉素；与标准的青霉素/链霉素鸡尾酒相比，这种抗生素的细胞毒性要低得多。