3）加入足量的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS，使其浸没组织块，并加入胶原酶至需要工作浓度；

4）于37℃孵育4-18 h。消化时使用水平摇床以及用3 mM的CaCl₂补充消化可以提高消化效率。

5） 已分散开的细胞可使用不锈钢或尼龙网筛筛得，收集备用。未完全解离的组织另外添加适量的新鲜胶原酶工作液于37℃继续孵育；

6）利用不含胶原酶的HBSS洗涤收集的细胞数次；

7）细胞培养液重悬上述细胞，利用自动细胞计数器或其他方法计算活细胞密度。

8）于细胞培养皿上利用合适细胞培养基接种细胞。

3． 器官灌注

1）向37℃预热的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS中加入胶原酶，另添加3 mM的CaCl₂有助于提高分离效率；

2）按照已优化的速率对相应的器官灌注胶原酶工作液；

3）将上述过程中回收的灌注液流经不锈钢或尼龙网筛，从而将已解离的细胞或小片段组织块与较大团块分离开来，未充分解离的组织需利用新鲜胶原酶工作液于37℃进一步孵育；

4）利用不含胶原酶的HBSS洗涤收集的细胞数次；

5）细胞培养液重悬上述细胞，利用自动细胞计数器或其他方法计算活细胞密度。

6）于细胞培养皿上利用合适细胞培养基接种细胞。

HB221202

Q：只用于分离细胞，选哪种胶原酶合适？

A：对于组织解离，常使用粗制胶原酶制剂，例如弹性蛋白酶，胰蛋白酶或木瓜蛋白酶等；对于胶原蛋白结构和生物合成研究，常使用更高纯度的胶原酶制剂，不含其他蛋白水解活性。

Q：要把肿瘤细胞分散成单个细胞做流式检测，选择哪一种胶原酶比较适合？需要区分肿瘤发生的部位吗？后续用来做流式，不同消化强度对细胞表面抗原的影响大吗？

A：会影响细胞表面抗原，可以选择对抗原影响较小的胶原酶Ⅲ、胶原酶Ⅳ。

Q：胶原酶使用会受到血清影响吗？

A：胶原不会受到培养细胞所用的血清影响。

Q：胶原酶的使用会受哪些抑制剂影响？

A：胶原酶的抑制剂有 EDTA  、EGTA 等；二是重金属离子（Hg2+,Pb2+,Cd2+）；还有一些化学试剂如 Cysteine、 histidine、DTT、2-mercaptoethanol、o-phenanthroline 等对胶原酶也有抑制作用。

Q：用 PBS 溶解可以吗？用什么工作液浓度溶解？

A：建议在 Hank’s，Earle’s 或者其他平衡盐溶液中溶解，推荐使用工作浓度 0.05 % ~0.5 % (w/v)。

Q：实验过程中消化作用不佳

A：(1)如果是酶活不强或钙离子不足导致，应在低温干燥条件下储存胶原酶，胶原酶溶液分装后冻存(2)如果是钙离子不足导致，应将胶原酶溶液中钙离子浓度设置为 5mM

Q：使用过程中出现细胞死亡

A：（1）如果是蛋白酶过量，应减少蛋白酶接触时间或是加入白蛋白或灭活血清（2）如果是 pH 改变应使用缓冲液（如 HBSS）；经常检查并重新调节 pH（3）如果氧气太少，应给消化液通无菌空气

Q： 实验中出现细胞受损怎么办？

A： 如果是蛋白酶过多导致，应减少蛋白酶用量或是加入白蛋白或灭活血清

[1] Sun X, He X, Zhang Y, et al. Inflammatory cell-derived CXCL3 promotes pancreatic cancer metastasis through a novel myofibroblast-hijacked cancer escape mechanism. Gut. 2022;71(1):129-147. doi:10.1136/gutjnl-2020-322744(IF:23.059)
[2] Wu B, Qiang L, Zhang Y, et al. The deubiquitinase OTUD1 inhibits colonic inflammation by suppressing RIPK1-mediated NF-κB signaling. Cell Mol Immunol. 2022;19(2):276-289. doi:10.1038/s41423-021-00810-9(IF:11.530)
[3] Yu Q, Han F, Yuan Z, et al. Fucoidan-loaded nanofibrous scaffolds promote annulus fibrosus repair by ameliorating the inflammatory and oxidative microenvironments in degenerative intervertebral discs. Acta Biomater. 2022;148:73-89. doi:10.1016/j.actbio.2022.05.054(IF:8.947)
[4] Feng C, Xiong Z, Wang C, et al. Folic acid-modified Exosome-PH20 enhances the efficiency of therapy via modulation of the tumor microenvironment and directly inhibits tumor cell metastasis. Bioact Mater. 2020;6(4):963-974. Published 2020 Oct 9. doi:10.1016/j.bioactmat.2020.09.014(IF:8.724)
[5] Wang Y, Sun Q, Ye Y, et al. FGF-2 signaling in nasopharyngeal carcinoma modulates pericyte-macrophage crosstalk and metastasis. JCI Insight. 2022;7(10):e157874. Published 2022 May 23. doi:10.1172/jci.insight.157874(IF:8.315)
[6] Zheng Q, Liu P, Gao G, et al. Mitochondrion-processed TERC regulates senescence without affecting telomerase activities. Protein Cell. 2019;10(9):631-648. doi:10.1007/s13238-019-0612-5(IF:7.575)
[7] Guo H, Yin W, Zou Z, et al. Quercitrin alleviates cartilage extracellular matrix degradation and delays ACLT rat osteoarthritis development: An in vivo and in vitro study. J Adv Res. 2020;28:255-267. Published 2020 Jun 24. doi:10.1016/j.jare.2020.06.020(IF:6.992)
[8] Wang Y, Zhao M, Li W, et al. BMSC-Derived Small Extracellular Vesicles Induce Cartilage Reconstruction of Temporomandibular Joint Osteoarthritis via Autotaxin-YAP Signaling Axis. Front Cell Dev Biol. 2021;9:656153. Published 2021 Apr 1. doi:10.3389/fcell.2021.656153(IF:6.684)
[9] Zhang W, Wang H, Yuan Z, et al. Moderate mechanical stimulation rescues degenerative annulus fibrosus by suppressing caveolin-1 mediated pro-inflammatory signaling pathway. Int J Biol Sci. 2021;17(5):1395-1412. Published 2021 Apr 3. doi:10.7150/ijbs.57774(IF:6.582)
[10] Zhu L, Yang Y, Yan Z, et al. Controlled Release of TGF-β3 for Effective Local Endogenous Repair in IDD Using Rat Model. Int J Nanomedicine. 2022;17:2079-2096. Published 2022 May 9. doi:10.2147/IJN.S358396(IF:6.400)
[11] Zhou T, Xiang DK, Li SN, Yang LH, Gao LF, Feng C. MicroRNA-495 Ameliorates Cardiac Microvascular Endothelial Cell Injury and Inflammatory Reaction by Suppressing the NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2018;49(2):798-815. doi:10.1159/000493042(IF:5.500)
[12] Zheng Y, Chen Y, Lu X, et al. Inhibition of Histone Deacetylase 6 by Tubastatin A Attenuates the Progress of Osteoarthritis via Improving Mitochondrial Function. Am J Pathol. 2020;190(12):2376-2386. doi:10.1016/j.ajpath.2020.08.013(IF:4.307)
[13] Wang C, Wang Y, Wang C, et al. Therapeutic application of 3B-PEG injectable hydrogel/Nell-1 composite system to temporomandibular joint osteoarthritis. Biomed Mater. 2021;17(1):10.1088/1748-605X/ac367f. Published 2021 Nov 19. doi:10.1088/1748-605X/ac367f(IF:3.715)
[14] Hu H, Luo SJ, Cao ZR, et al. Depressive Disorder promotes Hepatocellular Carcinoma metastasis via upregulation of ABCG2 gene expression and maintenance of self-renewal. J Cancer. 2020;11(18):5309-5317. Published 2020 Jul 9. doi:10.7150/jca.45712(IF:3.565)
[15] Du Y, Chen X, Yang H, et al. Expression of Oocyte Vitellogenesis Receptor Was Regulated by C/EBPα in Developing Follicle of Wanxi White Goose. Animals (Basel). 2022;12(7):874. Published 2022 Mar 30. doi:10.3390/ani12070874(IF:2.752)

产品描述

胶原酶（Collagenase）是一种蛋白酶，一种肽链内切酶，能够特异性的识别Pro-X-Gly-Pro序列（该序列高频率出现在胶原中，很少发现于其他蛋白中）并切割该序列中性氨基酸（X）和甘氨酸（Gly）之间的肽键。许多蛋白酶都能水解单链且变性的胶原多肽，但胶原酶是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内。

本品来源于溶组织梭菌（Clostridium histolyticum），是一种酶粗提物，不仅含有胶原酶（更准确的称法为梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A）），能够降解天然胶原和网状纤维。还含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分别能够有效水解

结缔组织和上皮组织细胞外基质内的其他蛋白，多糖和脂质，使得本品非常适用于组织消化。

目前商业化提供的细菌胶原酶主要根据胶原酶活性的差异，分为四种类型：胶原酶I型、II型、III型和IV型，在应用上有所偏向：1）胶原酶I（Type I Collagenase）：含有比较均匀的各种酶活力（包括胶原酶，酪蛋白酶，梭菌蛋白酶，胰蛋白酶活性）。通常用作上皮细胞、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的制备；2）胶原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心脏、骨、肌肉、胸腺和软骨等组织来源细胞的制备；3）胶原酶III（Type III Collagenase）：含有较低的蛋白酶活性，常用于乳腺细胞的制备；4）胶原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性，通常用于胰岛细胞的制备，或者需要维持受体完整性的细胞制备实验。

本品为II型胶原酶，≥125 U/mg solid，可用于心、甲状腺、唾液腺、肝、骨、软骨等组织和细胞的解离。

酶活力单位定义

在37℃，pH7.5 的条件下，5 h内水解胶原产生相当于1 µM L-亮氨酸的酶量定义为1个酶活力单位。

运输和保存方法

室温运输。4℃避光保存，2年有效。储存液-20℃避光冻存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！

使用方法

1. 胶原酶储存液的配制

向每管100 mg的胶原酶中加入1 mL的含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS（Hank’s平衡盐溶液，含Ca²⁺、Mg²⁺），轻轻旋涡震荡使其充分溶解，制备成100 mg/mL（即100×）的储存液。然后用低蛋白结合性的0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装成小份量，然后于-20℃避光冻存。

使用前于冰上解冻，避免反复冻融。其用于组织和细胞分散的常用浓度为：0.5-2.5 mg/mL，用于软骨消化的常用浓度为1-2 mg/mL，需要根据特定的实验条件或者参考相应的文献资料确定所需的最佳工作浓度。

2．组织的分离

1）使用无菌手术刀或剪刀将组织切成3-4 mm大小的组织块；

2）利用含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS洗涤组织块数次；