Hifair^®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair^®III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^®III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)₁₈，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

 

产品信息

货号	11139ES10 / 11139ES60
规格	10 T / 100 T

 

组分信息

组分编号	组分名称	11139ES10	11139ES60
11139-A	RNase-free H2O	1 mL	2×1 mL
11139-B	5×gDNA Digester Mix	30 μL	300 μL
11139-C	10×Hifair® III Super Buffer*	20 μL	200 μL
11139-D	Hifair® III RT Enzyme Mix**	10 μL	100 μL
11139-E	Random Primers N6 (50 μM)	10 μL	100 μL
11139-F	Oligo (dT)18 (50 μM)	10 μL	100 μL

*10×Hifair^® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。

** Hifair^® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。

 

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期18个月。

 

使用说明

1.关于逆转录引物的选择

1）如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈ ，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

2.第一链cDNA合成操作步骤

1）若实验需要去除残留基因组DNA

a.  gDNA消化

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分	使用量
RNase-free H2O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg-5 μg*
or mRNA	10 pg-500 ng*

表1 gDNA消化体系*

*若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为10 pg -1 μg；mRNA的投入量为10 pg-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

b. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	15 μL
10×Hifair® III Super Buffer	2 μL
Hifair® III RT Enzyme Mix	1 μL
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)18 (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
	or 1 μL
RNase-free H2O	to 20 μL

表2逆转录体系(以20 μL为例)*

*使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

1）逆转录引物：后续进行qPCR时，推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈ 1:1混合使用。

2）建议先加入10×Hifair^® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c. 逆转录标准程序设置

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表3逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度	时间
55℃	15 min
85℃	5 sec

表4逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

2）若实验无需去除残留基因组DNA

a. RNA模板变性

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5 min，迅速置于冰上，并静置3 min。

组分	使用量
RNase-free H2O	To 17 μL
Total RNA	10 pg -5 μg
or mRNA	10 pg-500 ng
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)18 (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
	or 1 μL

表5 RNA模板变性体系

b. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	17 μL
10×Hifair® III Super Buffer	2 μL
Hifair® III RT Enzyme Mix	1 μL

表6逆转录体系(以20 μL为例)*

c. 逆转录标准程序设置

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表7逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度	时间
55℃	15 min
85℃	5 sec

表8逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

3）miRNA第一链cDNA茎环法合成操作步骤

a.  gDNA消化

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分	使用量
RNase-free H2O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg -5 μg

表9 gDNA消化体系

b.  miRNA逆转录反应体系配制（20 μL体系）

组分	使用量
上一步的反应液	15 μL
10×Hifair® III Super Buffer	2 μL
Hifair® III RT Enzyme Mix	1 μL
Gene Specific Primer (10 μM)	1 μL
RNase-free H2O	to 20 μL

表10 miRNA逆转录体系(以20 μL为例)*

*1）建议先加入10×Hifair^® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

*2）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c.  miRNA逆转录标准程序设置

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

表11 miRNA标准扩增程序*

*a. 逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

 

注意事项

1. 反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。
2. 建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
3. 5×gDNA digester Mix、10×Hifair^® III Super Buffer、Hifair^® III RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀，并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器，枪头不要插入液面下过深。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5. qPCR实验推荐基因组去除步骤，保证结果更加真实可靠。
6. 本产品仅作科研用途！

 

Ver.CN20230407

Q：逆转录试剂盒可以逆转真菌（或其他物种）RNA 吗？有没有专门针对真菌（或其他物种）的RNA 逆转录的试剂盒呢？

A：RNA 的物种与逆转录没有很大关系，RNA 质量与逆转录有关。所以，得到 RNA 后， 逆转录试剂盒都可以用，没有特别针对的。

Q：RNase 残留降解RNA？

A：原因：若去除试剂中残留 RNase，会使 RNA 发生降解，减少了 RNA 模板量，导致效果差。

检测方法：RNA 去除试剂前后分别进行电泳检测，检测RNA 完整性。优化方法：选用无RNase 级别的 gDNA 去除试剂。

Q: miRNA茎环法逆转录可以用这款产品吗？

A: 可以的，设计特异性引物替代试剂盒中的引物加入到程序中。参考程序如下：

茎环引物（10uM) :1ul

上一步的反应液：15ul

10×super buffer：2ul

RT enzyme mix: 1ul

ddH2O:  1ul

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Q：逆转录反应中的引物如何选择？

A：根据实验目的不同，可按下列建议选择（选择指南可见下表）：

a）对于全长第一链 cDNA 合成，且模板为真核生物来源，推荐选择Oligo (dT)引物。b）当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源，推荐选择 Random Primers 引物。

c）基因特异性引物（GSP）是与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。d）若逆转录后续为 qPCR 实验，可将 Oligo (dT)与Random Primers 混合使用。

逆转录引物选择指南
	特征	优点	缺点	结合方式
Oligo (dT)	1）12-20 个 T； 2）与真核生物 mRNA 的3 ’ Poly A 尾配对。	可 合 成 全长 cDNA。	1 ） 仅扩增有 polyA 尾 的 mRNA； 2 ） 对模板质 量 要 求高。
Random Primers	1）6-9 个碱基； 2）可随机识别模板并结合。	适 合 复 杂结 构 和 微 量模板。	特异性低， 小片段多。
基因特异性  引  物 （GSP）	识别特定模板序列。	特异性强， 灵敏度高。	仅 合 成 特定的序列。

Q：能否用来做 miRNA/circRNA/lncRNA 的逆转录？

A：有 A 尾的 lncRNA 用预混液和 KIT （ 11123/11141/11121/11139） 都可以， circRNA、miRNA 和无 A 尾的 lncRNA 用  KIT（11121/11139）。microRNA 需要特殊的茎环引物，需特别针对的逆转录试剂盒。

Q：克隆逆转和定量逆转有什么区别？克隆逆转产物和定量逆转产物可以相互吗？

A：a）目的不同：克隆逆转后的 cDNA 后续用于基因克隆，后续实验以普通 PCR 为主； 定量逆转后的 cDNA 后续用于基因定量，后续实验以qPCR 为主。

2. 逆转录过程不同：克隆逆转使用 Oligo dT，保证合成的长度。随机引物使用较少； 定量逆转使用 Oligo dT 或随机引物，或两者混合使用。
3. 克隆逆转产物可用于 qPCR，但定量逆转产物不推荐用于普通 PCR，定量逆转试剂中含 Oligo (dT)与 Random Primers 混合引物，产物长度较短，可做短片段 PCR，过长的不适合。