附录2 常见问题与解答

HB230309

Q：为什么柱子反压过高？

A：可能是填料被堵塞；裂解液中含有微笑的固体颗粒，建议上柱前使用 0.22 µm/0.45µm 滤膜过滤。

Q：为什么洗脱组分中没有目的蛋白？

A：可能是抗体被降解；建议适当的提高洗脱pH。

Q：该产品可以直接使用吗？

A：Protein A 琼脂糖珠最好在使用前充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。

Q：该产品可以贮存在–20℃吗？

A：不可以，不可冷冻该产品。应置于 4°贮存。

[1] Yang L, Gu W, Cheung KH, et al. InsP₃R-SEC5 interaction on phagosomes modulates innate immunity to Candida albicans by promoting cytosolic Ca²⁺ elevation and TBK1 activity [published correction appears in BMC Biol. 2020 Nov 2;18(1):158]. BMC Biol. 2018;16(1):46. Published 2018 Apr 27. doi:10.1186/s12915-018-0507-6(IF:5.770)

产品描述

天然蛋白G（Protein G）是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白，与发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面的蛋白A类似，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体（单抗和多抗）的分离纯化。在与不用的免疫球蛋白亚类的结合特性上，ProteinA 和Protein G结合性能不太一样，相比ProteinA，   ProteinG 对牛、羊、马等多克隆抗体有更强的结合力，它还可以结合不能与ProteinA很好结合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1（详见附录1）。

本品使用的是基因改造后的蛋白G，不仅维持其本身的Ig亲和特性，同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合，rProtein G Agarose Resin以琼脂糖凝胶为基质，重组Protein G为配基，具有很高的物理化学稳定性。利用本品经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体，使用方便，应用广泛。

产品性质

保存方法

2~8℃保存，有效期2年。

需准备试剂

【注】建议以下缓冲液在使用前用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

结合/洗杂缓冲液：0.15M NaCl, 20mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5

使用方法

【注】上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。

1 rProtein G Agarose Resin的装填

将rProtein G Agarose Resin装入合适的层析柱中，注意避免产生气泡。

2 样品纯化

1）平衡：用5倍柱体积的结合Buffer平衡层析柱，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2）上样：将样品加到平衡好的rProtein G Agarose Resin中，保证目的蛋白与树脂充分接触，提高目的蛋白的回收率，收集流出液，待检测。

3）洗杂： 用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4）洗脱： 使用 5-10 倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5）清洗及保存：依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的 20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。

3 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

4 树脂清洗

随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量下降，影响柱子的性能，这时需对柱子进行清洗：

1）去除沉淀或变性物质

① 用2倍柱体积的6M 盐酸胍溶液进行清洗；

② 用5倍柱体积的PBS，pH 7.4 清洗。

2）去除由于疏水性吸附造成的非特异吸附物质

① 用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton™X-100清洗；

② 用5倍柱体积的PBS, pH 7.4 清洗。

注意事项

1. 请勿冷冻保存本产品。
2. Protein G琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
3. 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5. 本产品仅作科研用途！

附录1. 蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表