A尾法miRNA通用qPCR预混液|miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
产品说明书
FAQ
COA
已发表文献
microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22 nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用SYBR® Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本产品中的2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA Polymerase采用化学修饰的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。
本产品必须与本公司的Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（加A法）(Cat#11148ES)配套使用，以获得最终的实验结果。
产品组分
|
组分编号 |
组分名称 |
产品规格 |
|
|
11171ES03 (20 μL×100 rxn) |
11171ES08 (20 μL×500 rxn) |
||
|
11171-A |
2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
1 mL |
5×1 mL |
|
11171-B |
RNase-free H2O |
2×1 mL |
5×1 mL |
运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。
需自备的试剂及耗材
1）无核酸酶污染的枪头及离心管。
2）PCR上游引物（Forward Primer）。
Forward Primer设计原则
通常以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T。Tm值建议在65℃左右。可适当在引物的5’端添加若干个G或C碱基以增加Tm值，也可适当在5’或3’端去掉若干碱基以减少Tm值，注意避免引入二级结构。
注意事项
1）使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
2）实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
3）本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途！
操作步骤
一、体系配制
1）将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。
2）将试剂置于冰上，按照下表配制试剂。RNase-free H2O可替换为其他用于分子生物学实验的无核酸酶水。
【注】：没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
3）荧光定量PCR体系配制
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组分 |
体积 (μL) |
体积 (μL) |
终浓度 |
|
2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
10 μL |
25 μL |
1 × |
|
Forward Primer（自备） |
X |
X |
400 nM |
|
Reverse Primer (10 μM) |
0.8 μL |
2 μL |
400 nM |
|
cDNA |
X |
X |
– |
|
RNase-free H2O |
Up to 20 μL |
Up to 50 μL |
– |
【注】：a) miRNA第一链cDNA的加入量不要超过qRT-PCR体积的1/10。高浓度cDNA易导致非特异扩增，可对cDNA适当稀释10-1000倍。
b) Reverse Primer (10 μM) 来源于试剂盒11148ES。由于专利的保密性，miRNA加A法反转录后，cDNA下游引物序列不同厂商之间存在差异，建议使用翌圣加A法反转录试剂盒11148ES，以保证最终的实验结果。
二、PCR反应程序设置
可参考以下两个程序进行定量PCR反应。
a. 荧光定量PCR常规扩增程序（两步法）
|
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
预变性 |
95℃ |
10 min |
1 |
|
变性 |
95℃ |
15 sec |
35-40 |
|
退火/延伸 |
60℃ |
20 sec |
|
|
熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 | 1 | |
b. 荧光定量PCR快速扩增程序（两步法）
|
循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
|
预变性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
|
变性 |
95℃ |
5 sec |
40 |
|
退火/延伸 |
60℃ |
20 sec |
|
|
熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 |
1 |
|
【注】：
1）退火/延伸温度和时间可根据实验要求适当调整。
2）常规程序与快速程序根据实验仪器选择，例如：ABI QuantStudio 5等仪器可以进行快速程序设置，Bio-Rad CFX96等仪器不可设置快速程序，需要进行常规程序设置。
HB221202
microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22 nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用SYBR® Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本产品中的2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA Polymerase采用化学修饰的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。
本产品必须与本公司的Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（加A法）(Cat#11148ES)配套使用，以获得最终的实验结果。
产品组分
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组分编号 |
组分名称 |
产品规格 |
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11171ES03 (20 μL×100 rxn) |
11171ES08 (20 μL×500 rxn) |
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11171-A |
2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
1 mL |
5×1 mL |
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11171-B |
RNase-free H2O |
2×1 mL |
5×1 mL |
运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。
需自备的试剂及耗材
1）无核酸酶污染的枪头及离心管。
2）PCR上游引物（Forward Primer）。
Forward Primer设计原则
通常以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T。Tm值建议在65℃左右。可适当在引物的5’端添加若干个G或C碱基以增加Tm值，也可适当在5’或3’端去掉若干碱基以减少Tm值，注意避免引入二级结构。
注意事项
1）使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
2）实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
3）本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
5）本产品仅作科研用途！
操作步骤
一、体系配制
1）将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。
2）将试剂置于冰上，按照下表配制试剂。RNase-free H2O可替换为其他用于分子生物学实验的无核酸酶水。
【注】：没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
3）荧光定量PCR体系配制
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组分 |
体积 (μL) |
体积 (μL) |
终浓度 |
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2×Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
10 μL |
25 μL |
1 × |
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Forward Primer（自备） |
X |
X |
400 nM |
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Reverse Primer (10 μM) |
0.8 μL |
2 μL |
400 nM |
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cDNA |
X |
X |
– |
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RNase-free H2O |
Up to 20 μL |
Up to 50 μL |
– |
【注】：a) miRNA第一链cDNA的加入量不要超过qRT-PCR体积的1/10。高浓度cDNA易导致非特异扩增，可对cDNA适当稀释10-1000倍。
b) Reverse Primer (10 μM) 来源于试剂盒11148ES。由于专利的保密性，miRNA加A法反转录后，cDNA下游引物序列不同厂商之间存在差异，建议使用翌圣加A法反转录试剂盒11148ES，以保证最终的实验结果。
二、PCR反应程序设置
可参考以下两个程序进行定量PCR反应。
a. 荧光定量PCR常规扩增程序（两步法）
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
10 min |
1 |
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变性 |
95℃ |
15 sec |
35-40 |
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退火/延伸 |
60℃ |
20 sec |
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熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 | 1 | |
b. 荧光定量PCR快速扩增程序（两步法）
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循环步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
10 sec |
1 |
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变性 |
95℃ |
5 sec |
40 |
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退火/延伸 |
60℃ |
20 sec |
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熔解曲线阶段 |
仪器默认设置 |
1 |
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【注】：
1）退火/延伸温度和时间可根据实验要求适当调整。
2）常规程序与快速程序根据实验仪器选择，例如：ABI QuantStudio 5等仪器可以进行快速程序设置，Bio-Rad CFX96等仪器不可设置快速程序，需要进行常规程序设置。
HB221202
Q: 加A法搭配你们的哪一款逆转录试剂？
A: 推荐搭配11148ES
Q: 除了加A法，茎环法推荐哪款产品做逆转录和qPCR？
A: 茎环法逆转录推荐用11139ES搭配自己的茎环引物；qPCR推荐使用11170ES。
Q: 茎环法和加A法的区别是什么？
A: 茎环法和加A法都可以用于miRNA的反转录。
茎环法最大的特点是其逆转录和qPCR都是序列特异性的。但由于茎环引物的特异性，针对同一样本中不同的目的miRNA，需要配制不同的逆转录体系。简单来说，就是茎环法特异性更好，但需要设计茎环引物，并且一次逆转录只适用于一个miRNA。
加A法相对更简单一些，但它是将所有的miRNA反转，所以后续的qPCR的假阳性的可能性会更高一点。
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