Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair®III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快,且热稳定性大幅度提高,可耐受高达60℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair®III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可合成长达19.8 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester Mix,可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染,保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物:Random Primers N6和Oligo (dT)18,用户可根据需要,选择Random Primers N6,Oligo (dT)18Gene Specific Primers作为逆转录引物,合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

 

产品信息

货号

11139ES10 / 11139ES60

规格

10 T / 100 T

 

组分信息

组分编号

组分名称

11139ES10

11139ES60

11139-A

RNase-free H2O

1 mL

2×1 mL

11139-B

5×gDNA Digester Mix

30 μL

300 μL

11139-C

10×Hifair® III Super Buffer*

20 μL

200 μL

11139-D

Hifair® III RT Enzyme Mix**

10 μL

100 μL

11139-E

Random Primers N6 (50 μM)

10 μL

100 μL

11139-F

Oligo (dT)18 (50 μM)

10 μL

100 μL

*10×Hifair® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。

** Hifair® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。

 

储存条件

-25~-15℃避光储存,有效期18个月。

 

使用说明

1.关于逆转录引物的选择

1)如果模板为真核生物来源,建议选择Oligo (dT)18 ,与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。

2)原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3)Random Primers N6适用性较广,适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

2.第一链cDNA合成操作步骤

1)若实验需要去除残留基因组DNA

a.  gDNA消化

RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分

使用量

RNase-free H2O

To 15 μL

5×gDNA Digester Mix

3 μL

Total RNA

10 pg-5 μg*

or mRNA

10 pg-500 ng*

1 gDNA消化体系*

*若后续实验为qPCR,Total RNA投入量为10 pg -1 μg;mRNA的投入量为10 pg-100 ng。若基因的表达丰度很低,最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

b. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

上一步的反应液

15 μL

10×Hifair® III Super Buffer

2 μL

Hifair® III RT Enzyme Mix

1 μL

Random Primers N6 (50 μM)

1 μL

or Oligo (dT)18 (50 μM)

or Gene Specific Primer (2 μM)

or 1 μL

or 1 μL

RNase-free H2O

to 20 μL

2逆转录体系(以20 μL为例)*

*使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。

1)逆转录引物:后续进行qPCR时,推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。

2)建议先加入10×Hifair® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物,以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3)体系配制完成后,请用移液器轻轻吹打混匀。

c. 逆转录标准程序设置

温度

时间

25℃

5 min

55℃

15 min

85℃

5 min

3逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1)逆转录温度:推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到60℃。

2)逆转录时间:后续进行qPCR时,推荐15 min;若后续用于PCR时,推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度

时间

55℃

15 min

85℃

5 sec

4逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量(≤55%)或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。

2)若实验无需去除残留基因组DNA

a. RNA模板变性

RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5 min,迅速置于冰上,并静置3 min。

组分

使用量

RNase-free H2O

To 17 μL

Total RNA

10 pg -5 μg

or mRNA

10 pg-500 ng

Random Primers N6 (50 μM)

1 μL

or Oligo (dT)18 (50 μM)

or Gene Specific Primer (2 μM)

or 1 μL

or 1 μL

5 RNA模板变性体系

b. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

上一步的反应液

17 μL

10×Hifair® III Super Buffer

2 μL

Hifair® III RT Enzyme Mix

1 μL

6逆转录体系(以20 μL为例)*

c. 逆转录标准程序设置

温度

时间

25℃

5 min

55℃

15 min

85℃

5 min

7逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1)逆转录温度:推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到60℃。

2)逆转录时间:后续进行qPCR时,推荐15 min;若后续用于PCR时,推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度

时间

55℃

15 min

85℃

5 sec

8逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量(≤55%)或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。

3)miRNA第一链cDNA茎环法合成操作步骤

a.  gDNA消化

RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分

使用量

RNase-free H2O

To 15 μL

5×gDNA Digester Mix

3 μL

Total RNA

10 pg -5 μg

9 gDNA消化体系

b.  miRNA逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

上一步的反应液

15 μL

10×Hifair® III Super Buffer

2 μL

Hifair® III RT Enzyme Mix

1 μL

Gene Specific Primer (10 μM)

1 μL

RNase-free H2O

to 20 μL

10 miRNA逆转录体系(以20 μL为例)*

*1)建议先加入10×Hifair® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物,以保证完全抑制gDNA digester的活性。

*2)体系配制完成后,请用移液器轻轻吹打混匀。

c.  miRNA逆转录标准程序设置

温度

时间

25℃

5 min

55℃

15 min

85℃

5 min

11 miRNA标准扩增程序*

*a. 逆转录时间:后续进行qPCR时,推荐15 min;若后续用于PCR时,推荐30 min-60 min。

 

注意事项

  1. 反应液的配制应在冰上操作完成,操作过程应避免RNase污染。
  2. 建议RNA是溶于水而不是TE中,因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
  3. 5×gDNA digester Mix、10×Hifair® III Super Buffer、Hifair® III RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀,并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器,枪头不要插入液面下过深。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  5. qPCR实验推荐基因组去除步骤,保证结果更加真实可靠。
  6. 本产品仅作科研用途!

 

Ver.CN20230407

Q逆转录反应中的引物如何选择?

A根据实验目的不同,可按下列建议选择选择指南可见下表

a)对于全长第一链 cDNA 合成,且模板为真核生物来源,推荐选择Oligo (dT)引物。b)当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源,推荐选择 Random Primers 引物。

c)基因特异性引物(GSP)是与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。d)若逆转录后续为 qPCR 实验,可将 Oligo (dT)与Random Primers 混合使用。

逆转录引物选择指南

 

特征

优点

缺点

结合方式

Oligo (dT)

1)12-20 个

T;

2)与真核生 mRNA 3 ’ Poly A 尾配对。

全长 cDNA。

1   polyA

mRNA; 2  对模板 高。

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Random Primers

1)6-9 个碱基;

2)可随机识别模板并结合。

杂结

量模板。

特异性低, 小片段多。

Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

基因特异    

GSP)

识别特定模板序列。

特异性强, 灵敏度高。

特定的序列。

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Q能否用来做 miRNA/circRNA/lncRNA 的逆转录?

A A 尾的 lncRNA 用预混液和 KIT  11123/11141/11121/11139) 都可以, circRNAmiRNA 和无 A 尾的 lncRNA   KIT11121/11139microRNA 需要特殊的茎环引物,需特别针对的逆转录试剂盒。

Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

Q克隆逆转和定量逆转有什么区别?克隆逆转产物和定量逆转产物可以相互吗?

Aa)目的不同:克隆逆转后的 cDNA 后续用于基因克隆,后续实验以普通 PCR 为主; 定量逆转后的 cDNA 后续用于基因定量,后续实验以qPCR 为主。

  1. 逆转录过程不同:克隆逆转使用 Oligo dT,保证合成的长度。随机引物使用较少; 定量逆转使用 Oligo dT 或随机引物,或两者混合使用。
  2. 克隆逆转产物可用于 qPCR,但定量逆转产物不推荐用于普通 PCR,定量逆转试剂中含 Oligo (dT)与 Random Primers 混合引物,产物长度较短,可做短片段 PCR,过长的不适合。

Q逆转录试剂盒可以逆转真菌(或其他物种)RNA 吗?有没有专门针对真菌(或其他物种)的RNA 逆转录的试剂盒呢?

ARNA 的物种与逆转录没有很大关系,RNA 质量与逆转录有关。所以,得到 RNA 后, 逆转录试剂盒都可以用,没有特别针对的。

QRNase 残留降解RNA?

A原因:若去除试剂中残留 RNase,会使 RNA 发生降解,减少了 RNA 模板量,导致效果差。

检测方法:RNA 去除试剂前后分别进行电泳检测,检测RNA 完整性。优化方法:选用无RNase 级别的 gDNA 去除试剂。

Q: miRNA茎环法逆转录可以用这款产品吗?

A: 可以的,设计特异性引物替代试剂盒中的引物加入到程序中。参考程序如下:

茎环引物(10uM) :1ul

上一步的反应液:15ul

10×super buffer:2ul

RT enzyme mix: 1ul

ddH2O:  1ul

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[3] Liu X, Zhan T, Gao Y, et al. Benzophenone-1 induced aberrant proliferation and metastasis of ovarian cancer cells via activated ERα and Wnt/β-catenin signaling pathways. Environ Pollut. 2022;292(Pt B):118370. doi:10.1016/j.envpol.2021.118370(IF:8.071)
[4] Li C, Song J, Guo Z, et al. EZH2 Inhibitors Suppress Colorectal Cancer by Regulating Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Front Immunol. 2022;13:857808. Published 2022 Apr 1. doi:10.3389/fimmu.2022.857808(IF:7.561)
[5] Wu Z, Lu Z, Li L, et al. Identification and Validation of Ferroptosis-Related LncRNA Signatures as a Novel Prognostic Model for Colon Cancer. Front Immunol. 2022;12:783362. Published 2022 Jan 26. doi:10.3389/fimmu.2021.783362(IF:7.561)
[6] Zhang Y, Hu R, Xi B, Nie D, Xu H, Liu A. Mechanisms of Senescence-Related NKG2D Ligands Release and Immune Escape Induced by Chemotherapy in Neuroblastoma Cells. Front Cell Dev Biol. 2022;10:829404. Published 2022 Mar 2. doi:10.3389/fcell.2022.829404(IF:6.684)
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Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair®III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快,且热稳定性大幅度提高,可耐受高达60℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair®III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可合成长达19.8 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester Mix,可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染,保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物:Random Primers N6和Oligo (dT)18,用户可根据需要,选择Random Primers N6,Oligo (dT)18Gene Specific Primers作为逆转录引物,合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

 

产品信息

货号

11139ES10 / 11139ES60

规格

10 T / 100 T

 

组分信息

组分编号

组分名称

11139ES10

11139ES60

11139-A

RNase-free H2O

1 mL

2×1 mL

11139-B

5×gDNA Digester Mix

30 μL

300 μL

11139-C

10×Hifair® III Super Buffer*

20 μL

200 μL

11139-D

Hifair® III RT Enzyme Mix**

10 μL

100 μL

11139-E

Random Primers N6 (50 μM)

10 μL

100 μL

11139-F

Oligo (dT)18 (50 μM)

10 μL

100 μL

*10×Hifair® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。

** Hifair® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。

 

储存条件

-25~-15℃避光储存,有效期18个月。

 

使用说明

1.关于逆转录引物的选择

1)如果模板为真核生物来源,建议选择Oligo (dT)18 ,与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA。

2)原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3)Random Primers N6适用性较广,适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

2.第一链cDNA合成操作步骤

1)若实验需要去除残留基因组DNA

a.  gDNA消化

RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分

使用量

RNase-free H2O

To 15 μL

5×gDNA Digester Mix

3 μL

Total RNA

10 pg-5 μg*

or mRNA

10 pg-500 ng*

1 gDNA消化体系*

*若后续实验为qPCR,Total RNA投入量为10 pg -1 μg;mRNA的投入量为10 pg-100 ng。若基因的表达丰度很低,最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

b. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

上一步的反应液

15 μL

10×Hifair® III Super Buffer

2 μL

Hifair® III RT Enzyme Mix

1 μL

Random Primers N6 (50 μM)

1 μL

or Oligo (dT)18 (50 μM)

or Gene Specific Primer (2 μM)

or 1 μL

or 1 μL

RNase-free H2O

to 20 μL

2逆转录体系(以20 μL为例)*

*使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。

1)逆转录引物:后续进行qPCR时,推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。

2)建议先加入10×Hifair® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物,以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3)体系配制完成后,请用移液器轻轻吹打混匀。

c. 逆转录标准程序设置

温度

时间

25℃

5 min

55℃

15 min

85℃

5 min

3逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1)逆转录温度:推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到60℃。

2)逆转录时间:后续进行qPCR时,推荐15 min;若后续用于PCR时,推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度

时间

55℃

15 min

85℃

5 sec

4逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量(≤55%)或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。

2)若实验无需去除残留基因组DNA

a. RNA模板变性

RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5 min,迅速置于冰上,并静置3 min。

组分

使用量

RNase-free H2O

To 17 μL

Total RNA

10 pg -5 μg

or mRNA

10 pg-500 ng

Random Primers N6 (50 μM)

1 μL

or Oligo (dT)18 (50 μM)

or Gene Specific Primer (2 μM)

or 1 μL

or 1 μL

5 RNA模板变性体系

b. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

上一步的反应液

17 μL

10×Hifair® III Super Buffer

2 μL

Hifair® III RT Enzyme Mix

1 μL

6逆转录体系(以20 μL为例)*

c. 逆转录标准程序设置

温度

时间

25℃

5 min

55℃

15 min

85℃

5 min

7逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1)逆转录温度:推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到60℃。

2)逆转录时间:后续进行qPCR时,推荐15 min;若后续用于PCR时,推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

温度

时间

55℃

15 min

85℃

5 sec

8逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量(≤55%)或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。

3)miRNA第一链cDNA茎环法合成操作步骤

a.  gDNA消化

RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分

使用量

RNase-free H2O

To 15 μL

5×gDNA Digester Mix

3 μL

Total RNA

10 pg -5 μg

9 gDNA消化体系

b.  miRNA逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

上一步的反应液

15 μL

10×Hifair® III Super Buffer

2 μL

Hifair® III RT Enzyme Mix

1 μL

Gene Specific Primer (10 μM)

1 μL

RNase-free H2O

to 20 μL

10 miRNA逆转录体系(以20 μL为例)*

*1)建议先加入10×Hifair® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物,以保证完全抑制gDNA digester的活性。

*2)体系配制完成后,请用移液器轻轻吹打混匀。

c.  miRNA逆转录标准程序设置

温度

时间

25℃

5 min

55℃

15 min

85℃

5 min

11 miRNA标准扩增程序*

*a. 逆转录时间:后续进行qPCR时,推荐15 min;若后续用于PCR时,推荐30 min-60 min。

 

注意事项

  1. 反应液的配制应在冰上操作完成,操作过程应避免RNase污染。
  2. 建议RNA是溶于水而不是TE中,因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
  3. 5×gDNA digester Mix、10×Hifair® III Super Buffer、Hifair® III RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀,并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器,枪头不要插入液面下过深。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  5. qPCR实验推荐基因组去除步骤,保证结果更加真实可靠。
  6. 本产品仅作科研用途!

 

Ver.CN20230407

Q逆转录反应中的引物如何选择?

A根据实验目的不同,可按下列建议选择选择指南可见下表

a)对于全长第一链 cDNA 合成,且模板为真核生物来源,推荐选择Oligo (dT)引物。b)当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源,推荐选择 Random Primers 引物。

c)基因特异性引物(GSP)是与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。d)若逆转录后续为 qPCR 实验,可将 Oligo (dT)与Random Primers 混合使用。

逆转录引物选择指南

 

特征

优点

缺点

结合方式

Oligo (dT)

1)12-20 个

T;

2)与真核生 mRNA 3 ’ Poly A 尾配对。

全长 cDNA。

1   polyA

mRNA; 2  对模板 高。

Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

Random Primers

1)6-9 个碱基;

2)可随机识别模板并结合。

杂结

量模板。

特异性低, 小片段多。

Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

基因特异    

GSP)

识别特定模板序列。

特异性强, 灵敏度高。

特定的序列。

Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

Q能否用来做 miRNA/circRNA/lncRNA 的逆转录?

A A 尾的 lncRNA 用预混液和 KIT  11123/11141/11121/11139) 都可以, circRNAmiRNA 和无 A 尾的 lncRNA   KIT11121/11139microRNA 需要特殊的茎环引物,需特别针对的逆转录试剂盒。

Hifair® III cDNA第一链合成试剂盒(含gDNA去除)|Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

Q克隆逆转和定量逆转有什么区别?克隆逆转产物和定量逆转产物可以相互吗?

Aa)目的不同:克隆逆转后的 cDNA 后续用于基因克隆,后续实验以普通 PCR 为主; 定量逆转后的 cDNA 后续用于基因定量,后续实验以qPCR 为主。

  1. 逆转录过程不同:克隆逆转使用 Oligo dT,保证合成的长度。随机引物使用较少; 定量逆转使用 Oligo dT 或随机引物,或两者混合使用。
  2. 克隆逆转产物可用于 qPCR,但定量逆转产物不推荐用于普通 PCR,定量逆转试剂中含 Oligo (dT)与 Random Primers 混合引物,产物长度较短,可做短片段 PCR,过长的不适合。

Q逆转录试剂盒可以逆转真菌(或其他物种)RNA 吗?有没有专门针对真菌(或其他物种)的RNA 逆转录的试剂盒呢?

ARNA 的物种与逆转录没有很大关系,RNA 质量与逆转录有关。所以,得到 RNA 后, 逆转录试剂盒都可以用,没有特别针对的。

QRNase 残留降解RNA?

A原因:若去除试剂中残留 RNase,会使 RNA 发生降解,减少了 RNA 模板量,导致效果差。

检测方法:RNA 去除试剂前后分别进行电泳检测,检测RNA 完整性。优化方法:选用无RNase 级别的 gDNA 去除试剂。

Q: miRNA茎环法逆转录可以用这款产品吗?

A: 可以的,设计特异性引物替代试剂盒中的引物加入到程序中。参考程序如下:

茎环引物(10uM) :1ul

上一步的反应液:15ul

10×super buffer:2ul

RT enzyme mix: 1ul

ddH2O:  1ul

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