使用说明：
1. 样品的准备
注：尽量使用新鲜样品，如果不能及时检测，请根据如下方法处理样品并妥善保存。样品冻存可能会影响样品的稳定性并导致检测数值低于预期结果。初次检测时，建议先尝试设置几个不同稀释度的样品，以保证有适当稀释度的样品检测数值在线性范围内。
a. 组织样品的准备：
(a) 把组织剪切成细小的碎片。
(b) 融解样品裂解液，混匀。
(c) 按照每20毫克组织加入100-200µl的比例加入样品裂解液(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的样品，可以适当减少裂解液的用量)，用适当的研磨仪(如碧云天的E6600 TissueMaster™手持式组织研磨仪)或玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
(d) 充分裂解后，4℃ 10,000-14,000g离心3-5分钟，取上清，冰上放置待测。
(e) 如果当天不进行检测，将样品置于-80℃冷冻保存。后续检测时取出后在冰上融化。处理好的组织样品请在一个月内使用，并避免反复冻融。
b. 细胞样品的准备：
(a) 融解样品裂解液，混匀。
(b) 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入100-200µl的比例加入样品裂解液。用枪吹打数下，使样品裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
(c) 对于悬浮细胞：4℃ 600g离心5分钟收集细胞，弃上清，用力把细胞弹散。按照6孔板每孔细胞加入100-200µl裂解液的比例加入样品裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。注：大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
(d) 充分裂解后，4℃ 10,000-14,000g离心3-5分钟，取上清，冰上放置待测。
(e) 样品裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100µl样品裂解液，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量至150µl或200µl。
(f) 如果当天不进行检测，将样品置于-80℃冷冻保存，检测时取出于冰上融化。处理好的细胞样品请在一个月内使用，并避免反复冻融。
c. 血清、血浆、尿液及培养液等液体样品的准备：
(a) 制备血清时建议使用肝素，避免使用EDTA类的螯合剂，因为螯合剂会和钙离子结合而影响检测结果。
(b) 生物液体样品及其它液体样品可直接检测。
(c) 建议适当稀释样品以获得最佳检测结果及保证检测数值在线性范围内。此处的样品稀释倍数记录为n。
(d) 如果当天不进行检测，推荐将样品置于-80℃冷冻保存，检测时取出于冰上融化。处理好的样品请在一个月内使用，并避免反复冻融。
2. 试剂盒的准备工作：
a. 检测缓冲液及显色液使用前应平衡至室温。
b. 标准品的制备
钙标准溶液的制备：取10µl 500mM的钙标准品，加入990µl去离子水，充分混匀后即可得到5mM的钙标准溶液。
参考下表稀释钙标准品，制备0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM浓度标准品。(备选：如果样品中钙含量比较高，可以考虑制备0、1、2、4、6、8、10mM浓度标准品，此时样品和标准品的用量须减少至5µl，详见步骤3b。)

注1：保证每个稀释度足够两个重复孔的使用量，如果重复孔更多，相应体积成比例增加即可。
注2：根据钙的原子量为40，可以从摩尔浓度和体积计算出每孔的钙离子量。
c. 检测工作液的配制：计算一次实验所需用量，把检测缓冲液与显色液以1:1混合配制成检测工作液待用。
注意：检测工作液需现用现配，时间太长可能会失效，建议配制好的检测工作液在30分钟内使用。
3. 标准曲线的绘制及样品测定：
a. 每个浓度标准品及样品推荐检测2个重复孔。
b. 96孔板中每孔加入50µl标准品或样品。样品也可2-50µl任意体积，并用去离子水补平到50µl，样品体积记录为V。(备选：如果样品中钙离子浓度比较高，可以考虑制备0、1、2、4、6、8、10mM浓度标准品，并且标准品和样品的用量全部都是5µl，样品可以使用1-5µl的任意体积，但须用去离子水补平到5µl。)
c. 每孔加入150µl检测工作液，混匀。
d. 室温避光孵育5-10分钟。注：须在30分钟内完成吸光度检测，时间过长所产生的颜色会逐渐变淡，从而影响检测效果。
e. 酶标仪测量575nm处的吸光度，制作标准曲线。
4. 样品中钙含量的计算：
a. 计算标准品组中每个浓度组的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个浓度标准品的吸光度。
b. 以钙标准品的钙离子量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。钙离子的标准曲线可以参考图2。
 

图2. 本钙含量显色检测试剂盒检测钙离子的标准曲线图。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

c. 根据标准曲线计算测试孔中的钙含量。
d. 根据如下计算公式，计算样品中钙浓度：
C = A×n/V (µg/µl) 或 C = (A×n/V)/40 (mol/L)
注：A为根据标准曲线确定的钙离子量(µg)
n为步骤1中样品稀释倍数
V为步骤3中加入的样品体积
40为钙的原子量
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