双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (高通量)说明书

双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (高通量)说明书



产品详情

货号

规格

价格

78EA10008-100T

100T

1,440.00

产品描述

报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控,萤火虫萤光素酶 和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence),这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围,同时检测的灵敏度高,可达到 10-20mol。两种催化反应最适浓度不同,因此互不干扰, 配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统,其中海肾萤光素酶常作为内参照。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为 61 kDa 的蛋白,在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下,催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin,在此过程中会发出波长约为 560 nm 的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为 36 kDa 的蛋白,在氧气存在的条件下,催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成 coelenteramide,在此过程中会发出波长约为 480 nm 的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时,可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化 luciferin 的发光,而不干扰海肾萤光素酶的活性,从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer))或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系,可以高效、灵敏地检测基因的表达。检测原理如图所示:

 

 

 1.荧光素酶报告基因反应原理图

 

产品组成

试剂盒组分:

名称

规格

保存条件

5x Universal lysis BufferULB

20 mL

-20℃

Fluc Buffer A

5 mL

-20℃

Fluc substrate

干粉

-20℃

Rluc Buffer B

干粉 5 mL

-20℃

50x Rluc substrate

100 μL

-20℃

运输与保存

冰袋运输,-20℃保存 个月,-80℃保存更长时间。

实验步骤

1. 试剂准备:

11x Universal lysis BufferULB)配置:取所需体积的 5x Universal lysis Buffer 临用前用三蒸水稀释至1x

2)Fluc buffer A 工作液:试剂盒开始启用时,将 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate 中,适当吹打摇匀至粉末充分溶解后,分装到棕色管中-20℃保存备用;

3)Rluc Buffer B 工作液:临用前取 50x Rluc substrate  Rluc Buffer B 稀释至 1x 用(按需配置),配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 内使用有效(试剂配置过程中注意避光)。

2. 细胞裂解:

1) 细胞裂解:取出孔板放置至恢复室温,加入适量体积 1x ULB 振荡器摇匀,室温裂解 15min。细胞裂解液推荐使用量:

 

细胞培养板型号

96 孔板

24 孔板

12 孔板

孔板

1x Universal lysis BufferULB/

30 μL

60 μL

80 μL

120 μL

 

2) 荧光酶标仪设定,正确开启仪器,点击检测,选择生物发光检测功能,根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积分时间,默认为增益 135,积分时间 10 s

3. 检测:

1)移液枪吹打混匀裂解液后,吸取 20 μL 到黑色孔板底部。样品数量过多时候建议使用移液枪经转移和后续加液操作,若使用四周不透光的培养板可省略转移操作

2)向每孔中加入 100 μL Fluc buffer A,轻柔快速吹打混匀三次后,室温孵育反应 5-10min 后,上机检测记录发光值(F 

  3)向每孔中加入 100 μL Rluc buffer B,轻柔快速吹打混匀三次后,室温孵育反应 5-10min 后,上机检测记录发光值(

为保证结果准确性,在加入 Fluc buffer A Rluc buffer B 后,请在 1h 内完成检测

 

实验案例分析

 96 孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态,第二天进行如下转染:1.含有FXR 基因启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒;2.含有 FXR 基因启动子区转录因子 E2 功能的重组表达载体质粒;3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染 6h 向每孔中加入不同单体药物培养 48h,其中设置空白溶剂 DMSO 组。最后按试剂盒说明书操作裂解随后进行荧光素酶报告基因活性检测,结果如下(对应孔中所标白色字体数值为阳性激动剂的激动倍数

 3 . 59 种单体药物对基因启动子区荧光素酶报告基因激动倍数热图(A1:为空白溶剂对照组;A2-J6: 59

 FDA 上市药物的实验组)

经过上述实验的高通量筛选确定 F3 孔对应单体药物对FXR 启动子区激动效果强,激动倍数为 45。同某进口P“品牌一同测定该药物对FXR 基因的激动曲线,并计算 EC50,结果如下:

 

 4.红色:金畔生物品牌测定 F3 单体药物激动 FXR 基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线;黄色:进P“品牌测定F3 单体药物激动 FXR 基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线(EC50

1. 数据分析:

1)实验设计:根据实验目的,每组实验均应设置空白对照组,对照组和处理组。

a. 空白对照组

背景 F:未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A

背景 R:未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B

注:空白对照组样品量须与实验样品量相同,且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。

b. 对照组:转染细胞未经实验因素处理 (即对照组 F 和对照组 R)

c. 实验组:转染细胞经实验化合物处理 (即实验组F 和实验组 R)

计算结果:对照组比值=(对照组 F-背景 F)/(对照组 R-背景 R),实验组比值=(实验组 F-背景 F/(实验组 R-背景 R)

 

表达倍数实验组比值/对照组比值。

注意事项

1) 反应温度:酶促反应对温度较为敏感,加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温2025

   (2) 检测仪器:能检测化学发光的仪器都适用,但由于不同仪器的设置和灵敏度不同,测得的光信号值也会不同。 检测板:为防止孔间干扰,推荐使用不透光酶标板。

3) 发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响,应确保同组内不同样本检测条件一致。

4) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套。

    (5) 本产品仅作科研用途!