4）母液遇水极易分解，若单次不能用完，建议分装保存，例如5 μL/管，用封口膜封口，并严格做到≤-20℃密封干燥保存。

5）建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7）本产品仅作科研用途！

试剂准备

1）（可选）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30 min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）Hanks•balanced salt solution（HBSS,不含Ca²⁺, Mg²⁺）（Cat No. 60148ES76）

使用方法（本实验方案仅供参考，为得到最理想实验结果，需根据具体的实验情况优化实验条件。）

1）Rhod-2/AM储存液的配制

利用高质量无水DMSO溶解Rhod-2/AM配制成2-5 mM的储存液，该储存液可分装于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回温至室温。

【注】：① 因为Rhod-2/AM在水中的溶解性和稳定性较差，不可用水溶性缓冲液配制Rhod-2/AM储存液。

② 溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。

2）Rhod-2/AM工作液的配制

利用合适缓冲液(如Hanks & Hepes )将Rhod-2/AM稀释成1-10 μM的工作液，具体稀释方法如1 mM母液配制1 mL浓度为4 µM工作液，用1 mL缓冲液稀释4 µL 1 mM母液即可，混匀。

【注】：① 典型工作液浓度为0.1-5 μM，对于大多数细胞，我们推荐加载浓度4-5 μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

② Rhod-2/AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3）（可选）如果Rhod-2/AM进入细胞的效果不好，可向 Rhod-2/AM/DMSO 储存液中加入适量20% Pluronic F127溶液，最终稀释至其终浓度为0.02-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Rhod-2/AM在缓冲液中聚合并能帮助其进入细胞。

【注】：Pluronic F127可降低Rhod-2/AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。

4）取出预培养的细胞，除去培养基，使用缓冲液洗涤细胞3次。

【注】：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM 体，从而降低Rhod-2/AM进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。

5）将 Rhod-2/AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养15-60 min，然后除去Rhod-2/AM工作液。

【注】：① 关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

       ② 降低加载温度可能会减少探针AM酯运载技术造成的探针区室化。

6）用不含探针缓冲液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的Rhod-2/AM工作液。然后加入缓冲液覆盖细胞。

7）37℃培养箱孵育约 20-30 min，以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。

【注】：（可选）对于含有阴离子通道蛋白的细胞，5-7步骤中可加入有机阴离子转运抑制剂probenecid（1-2.5 mM）或sulfinpyrazone(0.1-0.25 mM)到细胞外液以减少指示剂去酯后的渗漏。

8）共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等检测细胞。

【注】：某些细胞具有自体荧光会影响结果分析，需使用未加载探针细胞做对照，在结果分析时在同一波长下扣除自荧光。

HB230128

Q：荧光探针用什么缓冲液稀释？

A：工作液用最好是使用无血清培养基 HBSS 或是 PBS 等缓冲液进行稀释，稀释后的探针工作液即可

直接加入细胞进行检测。

Q:几种探针的应用的位置

A：如果是测定胞质内的钙离子建议选择 Fluo-3 4，如果是测定细胞器内较浓钙离子的实验建议采用Rhod-2

Q：荧光探针装载完多久后观察？

A：为减少各种可能的误差，尽量缩短探针装载后到仪器测定所用的时间(刺激时间除外)。

Q：使用了钙离子孵育后还可以使用抗体进行孵育共检测吗？

A：钙离子探针是要求活细胞检测，因此对于抗体检测应满足活细胞状态以及使用相应的抗体荧光颜

色应与所使用的探针颜色有区分度，不然将难以观察。

Q：rhpd-2染线粒体的时候为什么要4℃染色？

A：当温度在37℃时探针倾向于聚集在胞质，在4℃下更偏向于在线粒体中。推测在37度左右温态环境下，胞浆酯酶会变得活跃从而在Rhod-AM未能达到线粒体之前脱去结构上的AM基团而发出荧光。在冷态环境下，酶活性变缓，探针基团可以先附着于线粒体上而后才水解。

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产品描述

Rhod-2是一种可见光激发的高亲和力Ca²⁺指示剂，与其他可见光激发荧光探针如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有长波长，更适用于检测具有较高自荧光现象的细胞和组织内钙离子水平以及检测由光感受器和笼锁钙离子螯合剂光激活导致的钙离子释放。

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca²⁺探针具有以下特点：1）可被大多数设备的激发器有效激发，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca²⁺变化，从而降低了对活细胞的光毒性。3）Ca²⁺依赖性荧光强度增强，对Ca²⁺变化水平检测敏感度更高。4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。5）无光谱偏移。6）长波长钙离子探针，能够与GFP和绿色荧光探针兼容。7）特别定位在线粒体，以罗丹明结构为基础的Rhod-2, AM带正电荷，以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体，荧光显微镜下观察进入细胞呈现点状染色模式。

产品性质

运输和保存方法

室温运输。-20℃避光干燥保存，有效期1年。

注意事项

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）乙酰氧基甲基酯（Acetoxymethyl ester，AM）容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）第一次使用时，建议母液现配现用。且溶解后的试剂尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。