RCA(E1A)基因(腺病毒E1A基因)拷贝数检测试剂盒 RCA(E1A) Copynumber Detection Kit
产品说明书
FAQ
COA
已发表文献
RCA (E1A)基因拷贝数检测试剂盒可用于定量分析检测各种使用腺病毒载体相关的细胞治疗产品和基因治疗产品中可能发生的复制型腺病毒(Replication-competent Adenoviruses, RCA)的潜在风险；还可用于定量分析检测生物制品中宿主细胞，如HEK293和HEK293T细胞来源的风险基因E1A残留DNA的含量。
本试剂盒针对腺病毒上E1A基因序列设计特异性引物，采用探针法荧光定量PCR原理，快速特异的检测复制型腺病毒RCA风险情况以及宿主细胞来源的E1A残留DNA，其定量限可低至4.1 copies/μL水平，且配套有RCA (E1A) DNA Control（DNA定量参考品）。该试剂可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
41321ES50 |
41321ES60 |
|
41321-A |
RCA (E1A) qPCR Mix |
0.75 mL |
1.5 mL |
|
41321-B |
RCA (E1A)Primer&Probe Mix |
200 μL |
400 μL |
|
41321-C |
DNA Dilution Buffer |
1.8 mL×2管 |
1.8 mL×4管 |
|
41321-D |
RCA (E1A) DNA Control (1.64×107 copies/μL) |
25 μL |
50 μL |
|
41321-E |
IC* |
50 μL |
100 μL |
*IC：Internal control，内部对照
储存条件
1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41321-A和41321-B均需避光保存。
2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。
4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。
适用机型
包含但不限于以下仪器：
Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；
Bio-Rad：CFX96 Optic Module；
上海宏石医疗科技：SLAN-96S。
使用说明
1. RCA (E1A) DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀释液）将RCA (E1A) DNA Control定量参考品进行梯度稀释*，稀释浓度依次为1.64×106 copies/μL、1.64×105 copies/μL、1.64×104 copies/μL、1.64×103 copies/μL、1.64×102 copies/μL、1.64×101 copies/μL。具体操作如下：
1）将试剂盒中的RCA (E1A) DNA Control定量参考品和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。
2）取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。
3）在标记为Std0的1.5 mL离心管中加入90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL RCA DNA Control定量参考品，Std0即稀释为1.64×106 copies/μL的浓度，振荡混匀后低速离心10 sec，该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过3个月）**，使用时避免反复冻融。
4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***，再进行梯度稀释****，具体稀释方法如下：
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稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
|
Std1 |
10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×105 copies/μL |
|
Std2 |
10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×104 copies/μL |
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Std3 |
10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×103 copies/μL |
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Std4 |
10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×102 copies/μL |
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Std5 |
10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×101 copies/μL |
表1 标准品梯度稀释
*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试1.64×105 copies/μL~1.64×101 copies/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。
**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。
***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。
****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约15 sec。
2.待测样本TS的制备
根据实验设置待测样本TS，具体操作如下：
取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为TS，进行样本前处理，制备待测样本TS纯化液。
3. 样本加标回收质控ERC的制备
根据需要设置ERC中的RCA (E1A) DNA标准品浓度，以制备加1.64×104copies RCA (E1A) DNA量的ERC为例*，具体操作如下：
1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。
2）加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。
*一般建议样本加标量设置在样本中目的基因RCA (E1A)实际含量的0.8~1.5倍，如果样品中目的基因含量低于定量限，加标量应设置到定量限之内，以保证检测结果的可靠性。
4. 阴性抽提质控NCS的制备
根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：
1）取100 μL样本基质溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。
2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。
5. 无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：
1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液即15 μL RCA (E1A) qPCR Mix + 4 μL RCA Primer&Probe Mix + 1 μL IC，再加10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。
6. 反应体系
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组分 |
体积(μL) |
|
RCA (E1A) qPCR Mix* |
15 |
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RCA (E1A) Primer&Probe Mix |
4 |
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IC |
1 |
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DNA Template** |
10 |
|
总体积*** |
30 |
表2 标准品反应体系
*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。
**反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。
NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS
TS (Test Sample)：待测样本
ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如10 μL的1.64×103 copies/μL标准品后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC
***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。
下表为参考板位：
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
NTC |
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待测样本TS1 |
待测样本TS1 |
待测样本TS1 |
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标准曲线Std1 |
标准曲线Std1 |
标准曲线Std1 |
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|
|
B |
NTC |
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待测样本TS2 |
待测样本TS2 |
待测样本TS2 |
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标准曲线Std2 |
标准曲线Std2 |
标准曲线Std2 |
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C |
NTC |
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待测样本TS3 |
待测样本TS3 |
待测样本TS3 |
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标准曲线Std3 |
标准曲线Std3 |
标准曲线Std3 |
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D |
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标准曲线Std4 |
标准曲线Std4 |
标准曲线Std4 |
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|
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|
E |
NCS |
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样本加标ERC1 |
样本加标ERC1 |
样本加标ERC1 |
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标准曲线Std5 |
标准曲线Std5 |
标准曲线Std5 |
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|
|
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F |
NCS |
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样本加标ERC2 |
样本加标ERC2 |
样本加标ERC2 |
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G |
NCS |
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样本加标ERC3 |
样本加标ERC3 |
样本加标ERC3 |
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H |
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表3 上机参考板位
该示例是对RCA (E1A)基因拷贝数的qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度的RCA (E1A) DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。
7. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）
1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2）创建2个检测探针，Target 1命名为“RCA (E1A)-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；Target 2命名为“IC”，选择报告荧光基团为“CY5”，猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。
3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“164000”、“16400”、“1640”、“164”、“16.4”（含义为每孔DNA浓度，单位为copies/μL），并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“164000copies/μL”、“16400copies/μL”、“1640copies/μL”、“164copies/μL”、“16.4copies/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”，参比荧光勾选“ROX”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。
4）扩增程序设置：设置两步法扩增程序，反应体积30 μL。
|
循环步骤 |
温度（℃） |
时间 |
循环数 |
|
预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
|
变性 |
95℃ |
15 sec |
40 |
|
退火/延伸（收集荧光） |
60℃ |
30 sec |
表4 扩增程序
8. qPCR结果分析
1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。
3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为copies/μL。
4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。
5）根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%～150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.copies/µL)-样本测定值(eg.copies/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.copies)×100%。
6）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。
7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。
8）待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大，则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本，则优先考虑样本加标回收率结果，IC结果作为参考。
Ver.CN20230731
RCA (E1A)基因拷贝数检测试剂盒可用于定量分析检测各种使用腺病毒载体相关的细胞治疗产品和基因治疗产品中可能发生的复制型腺病毒(Replication-competent Adenoviruses, RCA)的潜在风险；还可用于定量分析检测生物制品中宿主细胞，如HEK293和HEK293T细胞来源的风险基因E1A残留DNA的含量。
本试剂盒针对腺病毒上E1A基因序列设计特异性引物，采用探针法荧光定量PCR原理，快速特异的检测复制型腺病毒RCA风险情况以及宿主细胞来源的E1A残留DNA，其定量限可低至4.1 copies/μL水平，且配套有RCA (E1A) DNA Control（DNA定量参考品）。该试剂可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
41321ES50 |
41321ES60 |
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41321-A |
RCA (E1A) qPCR Mix |
0.75 mL |
1.5 mL |
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41321-B |
RCA (E1A)Primer&Probe Mix |
200 μL |
400 μL |
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41321-C |
DNA Dilution Buffer |
1.8 mL×2管 |
1.8 mL×4管 |
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41321-D |
RCA (E1A) DNA Control (1.64×107 copies/μL) |
25 μL |
50 μL |
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41321-E |
IC* |
50 μL |
100 μL |
*IC：Internal control，内部对照
储存条件
1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41321-A和41321-B均需避光保存。
2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。
4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。
适用机型
包含但不限于以下仪器：
Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；
Bio-Rad：CFX96 Optic Module；
上海宏石医疗科技：SLAN-96S。
使用说明
1. RCA (E1A) DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀释液）将RCA (E1A) DNA Control定量参考品进行梯度稀释*，稀释浓度依次为1.64×106 copies/μL、1.64×105 copies/μL、1.64×104 copies/μL、1.64×103 copies/μL、1.64×102 copies/μL、1.64×101 copies/μL。具体操作如下：
1）将试剂盒中的RCA (E1A) DNA Control定量参考品和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。
2）取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。
3）在标记为Std0的1.5 mL离心管中加入90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL RCA DNA Control定量参考品，Std0即稀释为1.64×106 copies/μL的浓度，振荡混匀后低速离心10 sec，该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过3个月）**，使用时避免反复冻融。
4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***，再进行梯度稀释****，具体稀释方法如下：
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稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
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Std1 |
10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×105 copies/μL |
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Std2 |
10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×104 copies/μL |
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Std3 |
10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×103 copies/μL |
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Std4 |
10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×102 copies/μL |
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Std5 |
10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer |
1.64×101 copies/μL |
表1 标准品梯度稀释
*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试1.64×105 copies/μL~1.64×101 copies/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。
**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。
***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。
****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约15 sec。
2.待测样本TS的制备
根据实验设置待测样本TS，具体操作如下：
取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为TS，进行样本前处理，制备待测样本TS纯化液。
3. 样本加标回收质控ERC的制备
根据需要设置ERC中的RCA (E1A) DNA标准品浓度，以制备加1.64×104copies RCA (E1A) DNA量的ERC为例*，具体操作如下：
1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。
2）加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。
*一般建议样本加标量设置在样本中目的基因RCA (E1A)实际含量的0.8~1.5倍，如果样品中目的基因含量低于定量限，加标量应设置到定量限之内，以保证检测结果的可靠性。
4. 阴性抽提质控NCS的制备
根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：
1）取100 μL样本基质溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。
2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。
5. 无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：
1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液即15 μL RCA (E1A) qPCR Mix + 4 μL RCA Primer&Probe Mix + 1 μL IC，再加10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。
6. 反应体系
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组分 |
体积(μL) |
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RCA (E1A) qPCR Mix* |
15 |
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RCA (E1A) Primer&Probe Mix |
4 |
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IC |
1 |
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DNA Template** |
10 |
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总体积*** |
30 |
表2 标准品反应体系
*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。
**反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。
NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS
TS (Test Sample)：待测样本
ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如10 μL的1.64×103 copies/μL标准品后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC
***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。
下表为参考板位：
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
NTC |
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待测样本TS1 |
待测样本TS1 |
待测样本TS1 |
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标准曲线Std1 |
标准曲线Std1 |
标准曲线Std1 |
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B |
NTC |
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待测样本TS2 |
待测样本TS2 |
待测样本TS2 |
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标准曲线Std2 |
标准曲线Std2 |
标准曲线Std2 |
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C |
NTC |
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待测样本TS3 |
待测样本TS3 |
待测样本TS3 |
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标准曲线Std3 |
标准曲线Std3 |
标准曲线Std3 |
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D |
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标准曲线Std4 |
标准曲线Std4 |
标准曲线Std4 |
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E |
NCS |
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样本加标ERC1 |
样本加标ERC1 |
样本加标ERC1 |
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标准曲线Std5 |
标准曲线Std5 |
标准曲线Std5 |
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F |
NCS |
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样本加标ERC2 |
样本加标ERC2 |
样本加标ERC2 |
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G |
NCS |
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样本加标ERC3 |
样本加标ERC3 |
样本加标ERC3 |
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H |
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表3 上机参考板位
该示例是对RCA (E1A)基因拷贝数的qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度的RCA (E1A) DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。
7. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）
1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2）创建2个检测探针，Target 1命名为“RCA (E1A)-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；Target 2命名为“IC”，选择报告荧光基团为“CY5”，猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。
3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“164000”、“16400”、“1640”、“164”、“16.4”（含义为每孔DNA浓度，单位为copies/μL），并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“164000copies/μL”、“16400copies/μL”、“1640copies/μL”、“164copies/μL”、“16.4copies/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”，参比荧光勾选“ROX”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。
4）扩增程序设置：设置两步法扩增程序，反应体积30 μL。
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循环步骤 |
温度（℃） |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
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变性 |
95℃ |
15 sec |
40 |
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退火/延伸（收集荧光） |
60℃ |
30 sec |
表4 扩增程序
8. qPCR结果分析
1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的标曲：R²＞0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。
3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为copies/μL。
4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。
5）根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%～150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.copies/µL)-样本测定值(eg.copies/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.copies)×100%。
6）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。
7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。
8）待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大，则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本，则优先考虑样本加标回收率结果，IC结果作为参考。
Ver.CN20230731
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