Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的反转录模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16815ES40

16815ES60

16815-A

4× Hifair® FCD RT Mix

200 μL

500 μL

16815-B

RNase Free H2O

2 mL

5 mL

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 25

3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)

本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

4 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

5 qPCR反应程序(常规)

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

 

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)

暂无内容

 

Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的反转录模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16815ES40

16815ES60

16815-A

4× Hifair® FCD RT Mix

200 μL

500 μL

16815-B

RNase Free H2O

2 mL

5 mL

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 25

3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)

本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

4 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

5 qPCR反应程序(常规)

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

 

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for probe)

暂无内容