2×实时定量PCR扩增预混液|Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法,High Rox)

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2×实时定量PCR扩增预混液|Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法,High Rox)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述
本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶（货号：10113ES），在预变性温度（95℃）加热30sec，UNICON® Taq抗体失活，释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时，配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适合低浓度模板的扩增，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。
Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及High Rox。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

适用机型
Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus.

运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。
本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

1. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质，4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

2. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11123ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途！
 

反应体系（推荐冰上配制）

组分

体积（μl）

体积（μl）

终浓度

 

Hieff UNICON® qPCR SYBR® Green Master Mix (抗体法，High Rox)

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

模板DNA

X

X

–

无菌超纯水

to 50

to 20

–

【注】： 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

d) 反应体系：推荐使用20 μl或50 μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

 

     扩增程序（两步法）                           扩增程序（三步法）

循环步骤

温度

时间

循环数

  

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

30 sec

1

  

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

  

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸

60℃

30 sec★

  

退火

55-60℃

20 sec
         

延伸

72℃

20 sec★

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

  

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

 

【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

a) 预变性时间：本反应条件适合大多数基因扩增，如果遇到含有复杂结构的基因可适当增加预变性时间至3-5min。

b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

引物设计指南

1）推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3）引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4）引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5）引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6）设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

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产品名称

货号

规格

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

11121ES60

100 T

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) 

11123ES60

100 T

Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix(No Rox )

11201ES08

5 mL

Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix(Low Rox Plus)

11202ES08

5 mL

Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix(High Rox Plus) 

11203ES08

5 mL

Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox)

11195ES08

5 mL

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11196ES08

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11197ES08

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11198ES08

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11199ES08

5 mL

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，High Rox)

11200ES08

5 mL

 

HB210824

Q：最近做相对定量实验，Ct 值一直在 30 以后，是否可以考虑用这一款产品?

A：可以，这款是高灵敏度的，针对低丰度样本开发优化的。

[1] Yan P, Li Z, Xiong J, et al. LARP7 ameliorates cellular senescence and aging by allosterically enhancing SIRT1 deacetylase activity. Cell Rep. 2021;37(8):110038. doi:10.1016/j.celrep.2021.110038(IF:9.423)
[2] Huang C, Zhang N, Xiong H, et al. Multi-Omics Analysis for Transcriptional Regulation of Immune-Related Targets Using Epigenetic Data: A New Research Direction. Front Immunol. 2022;12:741634. Published 2022 Jan 3. doi:10.3389/fimmu.2021.741634(IF:7.561)
[3] Ni Z, Huang C, Zhao H, et al. PLXNC1: A Novel Potential Immune-Related Target for Stomach Adenocarcinoma. Front Cell Dev Biol. 2021;9:662707. Published 2021 Jul 2. doi:10.3389/fcell.2021.662707(IF:6.684)
[4] Huang C, Huang R, Chen H, et al. Chromatin Accessibility Regulates Gene Expression and Correlates With Tumor-Infiltrating Immune Cells in Gastric Adenocarcinoma. Front Oncol. 2021;10:609940. Published 2021 Jan 5. doi:10.3389/fonc.2020.609940(IF:6.244)
[5] Wang Y, Chen Z, Zhang X, et al. Single-Base Resolution Mapping Reveals Distinct 5-Formylcytidine in Saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chem Biol. 2022;17(1):77-84. doi:10.1021/acschembio.1c00633(IF:5.100)
[6] Jian W, Deng XC, Munankarmy A, et al. KIF23 promotes triple negative breast cancer through activating epithelial-mesenchymal transition. Gland Surg. 2021;10(6):1941-1950. doi:10.21037/gs-21-19(IF:2.953)
[7] Lv J, Liu W, Shi G, et al. Human cardiac extracellular matrix-chitosan-gelatin composite scaffold and its endothelialization. Exp Ther Med. 2020;19(2):1225-1234. doi:10.3892/etm.2019.8349(IF:1.448)
[8] Cai Y, Zheng Q, Yao DJ. Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate dependent Rac exchange factor 1 is a diagnostic and prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma. World J Clin Cases. 2020;8(17):3774-3785. doi:10.12998/wjcc.v8.i17.3774(IF:1.013)

产品描述
本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶（货号：10113ES），在预变性温度（95℃）加热30sec，UNICON® Taq抗体失活，释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时，配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适合低浓度模板的扩增，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。
Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及High Rox。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

适用机型
Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus.

运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。
本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

1. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质，4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

2. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11123ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途！
 

反应体系（推荐冰上配制）

组分

体积（μl）

体积（μl）

终浓度

 

Hieff UNICON® qPCR SYBR® Green Master Mix (抗体法，High Rox)

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)

1

0.4

0.2 μM

模板DNA

X

X

–

无菌超纯水

to 50

to 20

–

【注】： 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

d) 反应体系：推荐使用20 μl或50 μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

 

     扩增程序（两步法）                           扩增程序（三步法）

循环步骤

温度

时间

循环数

  

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

30 sec

1

  

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

  

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸

60℃

30 sec★

  

退火

55-60℃

20 sec
         

延伸

72℃

20 sec★

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

  

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

 

【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

a) 预变性时间：本反应条件适合大多数基因扩增，如果遇到含有复杂结构的基因可适当增加预变性时间至3-5min。

b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

引物设计指南

1）推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3）引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4）引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5）引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6）设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

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货号

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Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

11121ES60

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11123ES60

100 T

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11201ES08

5 mL

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11202ES08

5 mL

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11203ES08

5 mL

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5 mL

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11196ES08

5 mL

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11197ES08

5 mL

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11198ES08

5 mL

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，Low Rox)

11199ES08

5 mL

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，High Rox)

11200ES08

5 mL

 

HB210824

Q：最近做相对定量实验，Ct 值一直在 30 以后，是否可以考虑用这一款产品?

A：可以，这款是高灵敏度的，针对低丰度样本开发优化的。

[1] Yan P, Li Z, Xiong J, et al. LARP7 ameliorates cellular senescence and aging by allosterically enhancing SIRT1 deacetylase activity. Cell Rep. 2021;37(8):110038. doi:10.1016/j.celrep.2021.110038(IF:9.423)
[2] Huang C, Zhang N, Xiong H, et al. Multi-Omics Analysis for Transcriptional Regulation of Immune-Related Targets Using Epigenetic Data: A New Research Direction. Front Immunol. 2022;12:741634. Published 2022 Jan 3. doi:10.3389/fimmu.2021.741634(IF:7.561)
[3] Ni Z, Huang C, Zhao H, et al. PLXNC1: A Novel Potential Immune-Related Target for Stomach Adenocarcinoma. Front Cell Dev Biol. 2021;9:662707. Published 2021 Jul 2. doi:10.3389/fcell.2021.662707(IF:6.684)
[4] Huang C, Huang R, Chen H, et al. Chromatin Accessibility Regulates Gene Expression and Correlates With Tumor-Infiltrating Immune Cells in Gastric Adenocarcinoma. Front Oncol. 2021;10:609940. Published 2021 Jan 5. doi:10.3389/fonc.2020.609940(IF:6.244)
[5] Wang Y, Chen Z, Zhang X, et al. Single-Base Resolution Mapping Reveals Distinct 5-Formylcytidine in Saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chem Biol. 2022;17(1):77-84. doi:10.1021/acschembio.1c00633(IF:5.100)
[6] Jian W, Deng XC, Munankarmy A, et al. KIF23 promotes triple negative breast cancer through activating epithelial-mesenchymal transition. Gland Surg. 2021;10(6):1941-1950. doi:10.21037/gs-21-19(IF:2.953)
[7] Lv J, Liu W, Shi G, et al. Human cardiac extracellular matrix-chitosan-gelatin composite scaffold and its endothelialization. Exp Ther Med. 2020;19(2):1225-1234. doi:10.3892/etm.2019.8349(IF:1.448)
[8] Cai Y, Zheng Q, Yao DJ. Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate dependent Rac exchange factor 1 is a diagnostic and prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma. World J Clin Cases. 2020;8(17):3774-3785. doi:10.12998/wjcc.v8.i17.3774(IF:1.013)