本试剂盒可直接快速地对小鼠组织（如鼠尾、鼠耳、鼠趾、肌肉等）样本进行PCR扩增，具有极强的样本兼容性。本试剂盒配备了强力的裂解缓冲液，可以快速裂解样品，释放基因组DNA。裂解液可以直接加入到PCR反应体系中，无需精提纯化，操作方便。此外，本试剂盒对样品投入量要求低，5 mg小鼠组织或1-5 mm鼠尾即可进行实验。
本试剂盒提供的2× Mouse Direct PCR Mix为2倍浓度的热启动PCR反应液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。
该试剂盒可用于转基因鉴定、小鼠基因分型等。

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
		10185ES50（50 T）	10185ES70（200 T）
10185-A	Buffer ML	1 mL×5	20 mL×1
10185-B	Buffer MT	0.6 mL	1.25 mL×2
10185-C	2× Mouse Direct PCR Mix	500 μL	1 mL×2

a)Buffer ML 为裂解缓冲液，包含了强力蛋白变性剂，请戴手套操作。

b)Buffer MT 为终止缓冲液，用以终止Buffer ML的裂解功能。

c)2× Mouse Direct PCR Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂、稳定剂和电泳指示染料等。

 

运输方法

冰袋运输。

保存方法

1. 组分A：2-8℃保存，有效期1年。使长时间多次使用，请分装冻存，避免交叉污染。
2. 组分B/C：-20℃保存，避免反复冻融。有效期1年。

操作方法

样品基因组DNA释放

1. 剪取5-10 mg动物组织或1-5 mm鼠尾，置于1.5 mL离心管中；

2. 在上述离心管中加入90 μL Buffer ML，轻轻涡旋使得样品完全被裂解液浸润，短暂离心；

3. 在恒温孵育仪中设置95℃孵育15 min；

4. 加入10 μL Buffer MT，轻弹混匀，终止裂解;

5. 选做步骤：12000 rpm离心2 min；

6. 将上清转移至新的离心管，4℃或-20℃保存或直接取上清用于后续PCR扩增。

【注】：组织应尽量剪碎，以便裂解反应更顺利进行。

【注】：95℃孵育，一般15 min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难裂解，可将时间延长至30 min。组织块不需完全裂解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。

 

PCR反应鉴定——PCR反应体系

组分	体积（μL）	终浓度
2× Mouse Direct PCR Mix	10	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	0.2-0.4 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	0.2-0.4 μM
裂解产物（DNA模板）	1	–
ddH2O	补足至 20 μL	–

 

【注】：各组分使用前应充分混匀。

a）模板使用量：建议按1-10%总体系量取用模板，20 μL体系建议采用1 μL上清液作为模板；

b）引物终浓度：0.2-0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度；

c）反应体系：推荐使用20 μL，也可根据使用习惯调整体系体积大小；

d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

PCR反应鉴定—PCR反应条件

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5 min	1
变性	94℃	10 sec	35
退火	60℃	20 sec
延伸	72℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

 

【注】：a）退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。

   b）延伸时间：请按30 sec/kb设定。

   c）扩增循环数：35个循环已可以扩增足量产物。

   d）电泳上样：取3-5 μL扩增产物上样即可。

对照反应

在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

注意事项
1.为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中，反复洗刷数次，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。

2. 建议使用新鲜的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
3. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率最佳。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5. 本产品仅作科研用途！

相关产品

产品名称	货号	规格
Animal Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 动物组织直接PCR试剂盒	10184ES50/70	50T/200 T
Animal Tissue PCR Component 动物组织PCR组分	10170ES50/70	50T/200 T
Animal Tissue Lysis Component 动物组织裂解组分	19698ES50/70	50T/200 T
Plant Tissue PCR Kit (With Dye)	10187ES50/70	50T/200 T

常见问题与解决方法

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× Mouse Direct PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。	使用新鲜的试剂。
	加入组织裂解液过量。	增大反应体系，或减少裂解液的用量。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系1-10%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

 

HB210824

Q：10185（Mouse Tissue Direct PCR Kit With Dye）和 10181（Mouse Tissue Direct PCR Kit）样本裂解温度和裂解操作一样吗？

A：均不一样。样本裂解温度区别： 10185：95℃，10-30min。10181：65℃，10-30 min。

裂解操作区别：10185：裂解组分A 和终止裂解组分 B 分开加，终止裂解混匀即可。 10181：裂解组分A 和终止裂解组分B 一起加，但终止裂解需要 5min。

Q：小鼠组织直接pcr 是鼠趾还是鼠尾好？需不需要纯化？

A：不需要纯化，离心取上清（选做），没比较鼠尾还是鼠趾效果，一般都是用鼠尾

[1] Luo J, Yang Q, Zhang X, et al. TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile. Cell. 2022;185(6):980-994.e15. doi:10.1016/j.cell.2022.02.010(IF:41.584)
[2] Zhao J, Chen J, Li YY, Xia LL, Wu YG. Bruton's tyrosine kinase regulates macrophage‑induced inflammation in the diabetic kidney via NLRP3 inflammasome activation. Int J Mol Med. 2021;48(3):177. doi:10.3892/ijmm.2021.5010(IF:4.101)