产品描述

细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒用于快速便捷分离细胞/组织细胞膜和细胞浆蛋白，抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜以及高尔基体膜等上的膜蛋白。主要工作原理：通过匀浆适度破碎细胞，经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。整个过程仅需约90 min即可完成，抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性测定等后续实验。

膜蛋白抽提试剂中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和EDTA等，后续不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定，但抽提获得的膜蛋白或细胞浆蛋白适合用于检测蛋白的磷酸化水平。

按照说明书步骤的用量（细胞2-5×107个；组织约100 mg），20127JP50/20127JP60可分别进行50个和100个样品的抽提，具体用量可根据不同的样品体积进行调整。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		20127JP50(50T)	20127JP60(100T)
20127-A	Reagent A试剂A	50 mL	100 mL
20127-B	Reagent B试剂B	15 mL	30 mL

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

注意事项

1）客户需自备PMSF，PMSF需现配现用，建议在抽提试剂加入到样品前2-3 min加入，以防失效。

2）利用本试剂盒抽提到的细胞膜/细胞浆蛋白可直接用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)（Yeasen Cat#20201）测定其浓度，但不适合用Bradford法测定。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4）本产品仅作科研用途！

使用方法

室温融解并混匀试剂A和B，融解后立即置于冰上。取适量的试剂A和B备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使其最终浓度为1 mM。

1 样品准备

1）细胞样品
① 细胞收集

贴壁细胞：培养细胞约2-5×107个，PBS清洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。 

悬浮细胞：培养细胞约2-5×107个，离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。

② 细胞清洗

用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600 g离心5 min沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600 g离心1 min，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，尽最大努力吸尽残留液体。

③ 细胞预处理：把1 mL试剂A（含PMSF）加入至上述细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10-15 min。

2）组织样品

取约100 mg组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1 mL试剂A（含PMSF），轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置10-15 min。

注：如果组织样品比较少，也可以使用更少的组织量，例如30-50 mg，后续试剂的用量及操作步骤不变；组织用量较少时，最后获得的膜蛋白也较少。

2 样品的破碎及破碎效果的鉴定

① 样品匀浆：把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30-50下。【匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。】

② 通常在匀浆30次后取约2-3 µL匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环（A shiny ring around the nuclei）或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。

注：如果没有适当的玻璃匀浆器，对于培养的细胞也可以采用反复冻融法来破碎细胞。把样品在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。如果细胞破碎的程度不足70%，可增加冻融次数，直到细胞破碎的程度大于70%。

3 去除细胞核和未破碎的细胞

 4℃，700 g离心10 min，小心收集上清液至一新的离心管中。

注：吸取上清时切勿接触沉淀！可以有约30-50 µL上清液残留不予吸取，以保证吸取的上清液有较高的纯度。

4 沉淀细胞膜碎片

4℃，14,000 g离心30 min，以沉淀细胞膜碎片。

5 收集细胞浆蛋白

吸取上清至1新的离心管中，即为细胞浆蛋白，可-70℃保存备用。吸取上清时可以有30-50 µL上清残留，以避免接触沉淀导致上清样品被污染。

6 抽提膜蛋白

4℃，14,000 g离心10 s，尽最大努力吸尽上清。可以轻轻触碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀。加入试剂B 200 µL（如有必要，也可加大到300 µL），最高速剧烈Vortex 5 s重悬沉淀，冰浴5-10 min。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4℃，14,000 g离心5 min，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。可-70℃保存备用。对于一些有特殊用途的膜蛋白，可自行配制适当的膜蛋白抽提试剂进行膜蛋白抽提。

Q：蛋白提取后保存方法和保存时间是多少？

A：在不被蛋白酶水解和细菌污染的条件下，提取的蛋白可于-80℃保存一年。

Q：蛋白抽提试剂盒适用对象？

A：目前我们的试剂盒只针对哺乳动物细胞和组织的提取，试剂盒中因不含去除细胞壁的成分，所有不能用于植物蛋白或细菌蛋白的提取。

Q：如何确保提取的细胞数量能够达到做EB 的标准？

A：一般 5X106 足矣，常规 WB 实验，每个上样孔要 105 个细胞，具体的也和靶细胞及提取的方式有关，如果提取的是膜蛋白或某细胞器内的蛋白，则应该增加细胞数。

Q：使用该抽提试剂盒得到的蛋白后续可以进行 WB 研究吗？

A：可以。除此之外，还可进行SDS-PAGE 和酶活性测定等后续实验。

 

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