klentaq聚合酶常见问题解答
问：Klentaq 和全长 Taq 有什么区别？
答：Klentaq 是 Taq 的截短版本，缺少酶的 5′>3′-外切核酸酶结构域。Klentaq 提高了保真度，并且比 Taq 更耐热、更坚固。Omni Klentaq 与 Klentaq 的保真度没有受到影响。Cesium Klentaq 的保真度略高于 Klentaq。其余突变酶的保真度尚未*确定。
与*级商业 Taq 相比，我们的突变酶的敏感性不会因牺牲其特殊的抑制抗性或冷敏感性特征而受到损害，并且允许从人类 DNA 中检测单基因拷贝。对于高产量扩增，Klentaq 酶通常需要比 Taq 更长的延伸时间，我们建议每个 1 kb DNA 靶标延伸 3-4 分钟。
问：你们的 LA 酶版本有什么优势？
答：“LA”代表“长而准确”。LA 酶与校对器混合，并以更好的保真度执行。此外，它们是长 DNA 靶标的优选酶，它们的表现异常出色。此外，它们通常更稳健，因此短目标扩增也可以从中受益。
*关于长靶点的提示：对于纯化的 DNA 模板，考虑酶浓度至少为 0.1 ul/1 kb 靶点/50-100 ul 反应体积，并允许每 1 kb 靶点有 3-4 分钟的延伸时间。对于粗制样品，可能需要更多的酶，具体取决于抑制水平（强烈建议使用酶滴定法）。考虑包括我们的 PEC 增强剂。
问：你们的抗抑制 Taq 酶和特殊 PCR 增强剂有哪些实际优势？
答：我们的新型酶是 Taq DNA 聚合酶的突变体，经过特别挑选，因为它们对广泛使用的强效 PCR 抑制剂具有高度抗性，例如全血、血清、血浆、尿液、腐殖酸、胆汁盐、植物组织提取物、各种食品相关抑制剂、GITC、乙醇等。因此，这些酶可以在大多数商业 Taq 产品无法执行的水平上耐受 PCR 中的此类抑制剂。Taq 突变体的这一*功能允许对各种临床、环境和法医原始样品进行直接 PCR，从而跳过 DNA 提取步骤。我们的 PCR 增强剂鸡尾酒 (PEC) 专为大多数抑制性粗制 PCR 样品配制，可进一步提高反应对抑制剂的耐受性。此外，我们的一些 PEC 旨在帮助处理困难的、富含 GC 的目标。
问：哪种酶和/或增强剂适合我的 PCR？
答：我们*的突变 Taq 酶选择，对各种强效 PCR 抑制剂具有耐受性，连同我们的 PCR 增强剂，可实现各种直接 PCR 应用，在许多情况下跳过 PCR 之前的 DNA 提取。酶/增强剂的选择取决于抑制物质的类型和浓度、qPCR 检测的类型、热启动 PCR 依赖性、模板的 GC 含量和其他因素。请参阅表格“哪种酶适合我”和“哪种增强剂适合我”。
问：Taq 突变酶是否适用于实时荧光定量 PCR？
答：我们所有的酶都非常适合嵌入染料，例如 SYBR Green。实际上，它们对 SYBR Green 的抗性比野生型 Taq 高 2-3 倍（这种染料在 1X 以上浓度时对普通 Taq 的 PCR 有抑制作用），这使它们在 qPCR 中具有一定的优势，特别是在一些荧光淬灭的反应中.
对于 TaqMan 检测，我们只推荐我们的全长 Taq 突变体（OmniTaq 系列或 CesiumTaq），但不推荐 Klentaq 突变体，因为它们缺乏切割 TaqMan 探针所需的 5′>3′- 核酸外切酶活性。
提示：对于复杂/抑制性 qPCR 样品，全长 Taq 和 Klentaq 酶的 1:1 混合物可能比单独使用全长酶效果更好。（Klentaqs 通常更坚固，半量的全长 Taq 酶足以用于探针切割）。如果你想试试这个，两个缓冲区也应该以相同的比例混合。
注意：我们的酶的 LA 版本不是适合 TaqMan 检测的，因为它们具有校对器活性。
问：我想直接从液体血液或血液 FTA 卡中扩增 DNA 靶标，无需提取 DNA，我应该选择什么产品，我需要修改我的循环条件吗？
答：我们建议您选择 Omni Klentaq、Omni Klentaq 2、OmniTaq 或 OmniTaq 3，必要时与 PEC 结合使用。我们强烈建议对此类粗样品进行酶滴定，因为更多的酶有助于更多的血液。请记住，血液样本的最佳酶量可能远远超过纯化 DNA 样本的最佳酶量，过量的酶可能导致过度扩增。通常推荐使用纯化 DNA 的酶量减少 5-10 倍。如果更高量的酶（至少 1 ul/25 ul 反应）不能令人满意，您可以加入 PEC 增强剂以进一步增强血液抵抗力。我们不建议您将 PEC 用于您的纯化 DNA，除非目标是富含 GC 且坚韧的。
您也可以使用我们用这些酶配制的 5X PCR 试剂盒（提供方便，但限制了滴定酶的选择）。
根据循环条件，我们建议您使用针对目标优化的 PCR 方案进行两个更改： A. 在 94-95 度下引入更长的初始加热步骤，即 8-10 分钟。在骑自行车之前，以及 B. 延长时间的两倍或三倍。请注意：如果您使用 PEC 增强剂，请记住它可能会将您的最佳退火温度降低几度。
注意：在为您的应用选择合适的酶后，同样的注意事项也适用于其他抑制性粗样品。
问：除了常规 PCR 或终点 PCR，我还可以使用抗抑制 Taq 突变体对全血进行 qPCR 吗？
答：是的，在协议中进行了一些简单的更改。我们的新型酶在 PCR 中可以抵抗高达 40% 的血液。因此，在血液的 qPCR 中，扩增应该没问题（如果你想在琼脂糖凝胶中运行它们，你应该看到预期的产品）。然而，qPCR 中扩增产物的光学检测的并发症源于血红素的荧光猝灭效应。如果您使用 SYBR Green，解决此问题的方法是简单地将输入染料浓度提高到 20-30 X（对于 5-10% 的血液），甚至更高，具体取决于血液浓度。这将补偿淬灭效应，并减少背景。
如果您使用 TaqMan 检测，同样由于血液的淬灭作用，我们建议将荧光探针浓度提高到 400-500 nM，并且不超过 4-5% 的血液。
注意：如果您扩增血清、血浆或其他非淬灭粗样品，则无需更改这些方案。
Q：DNA纯化后PCR结果为阴性，是什么原因，如何解决？
答：有些 DNA 提取试剂盒不能*去除起始材料中的 PCR 抑制剂，例如血液或植物组织成分或腐植酸，甚至会引入一些抑制剂，例如微量的苯酚、氯仿、硫氰酸胍或乙醇。在仔细滴定酶后，可以通过使用我们的 Taq 抑制剂抗性突变体来消除这个问题。（与粗制 PCR 样品相比，这对我们的酶来说应该是一项相对“容易”的工作，并且您必须确保您不会过量使用酶）。
问：你们的冷敏感 Taq 突变体和其他热启动酶有什么区别？
答：我们的冷敏感酶，例如 Cesium Taq、Cesium Klentaq AC 和 Cesium Klentaq C，在低温下表现出抑制的活性，而在 65 度以上时它们变得*活跃，因此在 PCR 中具有内在的热启动性能。与涉及抗 Taq 抗体或酶化学修饰的热启动 Taq 配方不同，它们不需要对循环条件进行任何更改。
问：为什么酶以体积/反应形式提供，而不是单位浓度？
答：一些 Taq 制造商提供的酶单位浓度是由传统 DNA 聚合酶活性测定法的略微修改版本确定的，该测定法是早期为非热稳定性 DNA 聚合酶开发的。该测定基于相对简单和“容易”的反应，仅测量核苷酸在 72 度下掺入带切口的 DNA 中，不考虑 PCR 条件下重要的酶质量，例如热稳定性和持续合成能力。因此，它本身不是 PCR 检测，并且不提供实际的“PCR 单位”。因此，它可能无法显示和预测 PCR 中真正的酶性能。因此，我们与其他制造商一样，相信为每个反应提供推荐的酶量对于最终用户来说更加可靠和实用。
Wayne Barnes 耐热酶的常见问题解答表
[实际上，这张表只有答案，没有问题。]
Klentaq1 是 Taq DNA 聚合酶的 Klenow 片段类似物。它是已知的最热稳定的 Taq 形式，它没有任何外切核酸酶或内切核酸酶，并且其晶体结构是已知的 [4]。
LA PCR 是长而准确的 PCR [1]。
根据美国 5,436,149，后缀 LA 表示已混入少量校对酶。
KlentaqLA (KTLA) 或 TaqLA 或 TthLA 是高温下进行长 DNA 延伸的最佳酶，例如引物定向诱变、长 PCR 或高保真 PCR，或用 PCR 产物引发（大引物）。（这些“酶”实际上是混合物，美国 5,436,149，由 Wayne Barnes 发明，现在由日本 Takara BIO, Inc. 所有）。
– 观看此空间以了解我在保真度方面的改进。
– TaqLA 由 Boehringer-Mannheim 出售为“Expand”，Takara Shuzo 出售为“ExTaq for LA PCR”，Life Technologies 出售为“Elongase”。
– Perkin Elmer 以“Tth XL”出售 TthLA，Clontech 以“Advantage Tth”出售 – Stratagene 的“TaqPlus”和“Taq Extender”也申请了美国 5,436,149。
“LA 技术”是将两种耐热酶混合在一起以获得更长、更准确（更高保真度）的 DNA 延伸的概念，通常用于 PCR。由 Wayne M. Barnes、美国 5,436,149 和国外同行发明。该现在归 Takara Shuzo 所有
以下两种推荐的缓冲液都假定您添加的 dNTP 和它们自己的（等摩尔）镁。如果您要添加 250 uM 每个 dNTP，请添加额外的 1 mM 镁（最终 3.5 mM）以实现此目的。
我们通过储备 10 mM 每个 dNTP、40 mM MgCl2（“10/40”）来做到这一点。然后，以下缓冲液将在 1X 时提供最佳的“过量”镁。[您可能更愿意在下面添加额外的 10 mM MgCl2，然后添加不含 Mg
的 dNTP。] Tris-HCl 原液由 Trizma Base 和 HCl 制成，浓度为 1 M Tris。然而，在室温下以 50 mM 在其他普通水中读取 pH 值。
* Klentaq1、KlentaqLA 和 Taquenase 的 10xKLA 为
* 500 mM Tris-HCl pH 9.2；160 mM 硫酸铵；25 毫米氯化镁；1% 吐温 20。
* Taq 和 TaqLA 的 10xTLA 相同，但只有 7.5 mM MgCl2。
* 包括用于高 GC 目标和多重 PCR 的最终 1.3 M 甜菜碱。还将加热步骤减少到 92-93 度。C. [从参考修改。2 & 5]
我们的“基准强度”Klentaq1、KTLA 和 TAQUENASE 相当于 wt Taq 的活性，如果它们用于 2 kb 的扩增。也就是说，0.1 ul 正好适合 50 ul 的反应大小。（野生型）Taq 的其他供应商将此称为 5 单位/ul；我们称其为“5 个 2kb-PCR 单元”/ul。更长的目标需要更多的 Klentaq1，最大为 0.65 ul/50 ul（目标大小为 35 kb；需要 KTLA 而不是 Klentaq1）。对于小于 2 kb 的目标，需要更少的 Klentaq1（但 0.1 ul 仍然可以）。
对于 2 kb 以下的 PCR 目标，如果延伸温度降低到 60 度，则需要 1/2 的酶（TaqLA 或 KlentaqLA）。并且延伸时间有所增加（即从 5′ 到 8′ 或 10’）。
Klentaq1 适用于短 PCR、RAPD 等。对于循环测序，它非常出色，但与 Taquenase 相比，它现在是旧技术。
KlentaqLA 是否在其 PCR 产物上留下钝端？部分是，部分不是。Klentaq1 确实添加了额外的 A。然而，要有效地做到这一点，需要一个额外的最后延长时间（20-30 分钟）。混合物中的校对
酶预计会去除这个额外的 A。哪一个获胜可能取决于您的 PCR 反应在完成
循环后得到的确切处理。可能性是
：4度过夜。
湾。25度吃午饭。
C。68度的咖啡。
d。上述任何一项，然后在 25 度时打个电话。
e. 上述以外。
– 我是否完成了上述实验条件，然后检查了
DNA 的末端？否。
– 我是否将我的产品克隆到平端载体中？是的，在 T4 DNA 聚合酶的钝端连接过程中使用 1 mM 六氨合氯化钴和 1 mM DTT。
– 我检查过整个克隆位点的阅读框吗？不是通过测序。
– 我是否曾经将 KlentaqLA 制造的阅读框关键 PCR 产物克隆到 ORF 的钝端？是的，根据编码产物的酶活性，大约一半的克隆似乎没有问题。
– 我用过 T 向量吗？不。
我们有数据表明 Taquenase 是循环测序的最佳酶。它必须与 MnSO4（除了 MgCl2）一起使用以获得最佳结果（Barnes，未发表）。不幸的是，由于和许可问题（见下文），您无法使用它。
1.25 M 甜菜碱（Sigma 编号 B-2629）也是一个不错的主意，可包含在循环测序反应中 [Barnes，未发表]
“Taquenase”(tm)是两种Taq突变体的组合。突变体 1 是 N 端缺失 Klentaq1（美国 5,436,149 和其他国家正在申请中。突变体 2 是由 Stan Tabor [3] 发现的 F667Y。F667Y 突变允许 ddNTP 减少 100 到 1000 倍才能正常工作。截至 3 月 25 日， 1997 年，这种突变被授予 Tabor & Richardson 并给 Amersham 的美国 5,614,365 涵盖。因此，除非我们获得 Amersham 的许可，否则我们无法提供这种酶，这是意料之中的。
我们认为没有涉及循环测序的（由 M. Craxton, MRC Cambridge, England 发明），也不是双脱氧测序（由 Fred Sanger, MRC Cambridge, England 发明）
。ddNTP 的意思是“双脱氧 NTPs”或“双脱氧终止子”。
NTP是指三磷酸核苷，聚合酶的组成部分。它们可以是 ATP、GTP、CTP 或 UTP==TTP。对于 RNA，有时为了清楚起见会添加前缀 r，例如 rCTP。对于 DNA，通常会添加前缀 d，例如 dATP。
双脱氧是指没有 OH 基团的两个位置（2′ 和 3′ 位置）。
Perkin Elmer 最近将其荧光 ddNTP 的价格（通过降低浓度）提高了 1000 倍。
DYE-ddNTP 的意思是“DYE 终止剂”或 DYE-双脱氧终止剂，它会变得很拗口。它们由 ABI 销售，但它们最初是由 Dupont 发明的，可从其子公司 NEN 获得，或即将推出。
DYE 是指荧光标记，由测序仪上的激光束激活。
Klentaq1 是已知的稳定的 Taq DNA 聚合酶形式，在 98 或 99 度的加热步骤中通过 PCR 测试。Taquenase 保持这种热稳定性。由于 Thermo Sequenase 是含有 7 个额外氨基酸的 Taquenase，我们相信它也具有这种更高的热稳定性。