Oligo dT 磁珠为表面包被有Oligo dT的1 μm磁性聚合物微球，具有单分散和磁响应性强等特点。磁珠通过Oligo dT与真核生物mRNA的poly A尾结构互补配对，快速高效从总RNA、细胞裂解物和带有poly A的体外转录RNA样本中分离纯化mRNA。纯化的mRNA可用于RT-PCR、cDNA文库构建、RACE、探针杂交和转录组测序等应用。
产品性质
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基质
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聚合物磁珠
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配体
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Oligo dT
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平均粒径
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1 μm
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磁核
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Fe3O4
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壳层
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聚合物
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磁性类型
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超顺磁性
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应用方向
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mRNA分离纯化
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应用方式
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手动/自动
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dA30结合量
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>300 pmol/mg 磁珠
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mRNA结合量
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~2 μg/mg磁珠
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磁珠浓度
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10 mg/mL
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保存溶液
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PBS, pH 7.4, 0.05% Proclin-300
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保存条件
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4℃
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保质期
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2年
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运输和保存方法
冰袋运输。4℃储存，有效期2年。
注意事项
1. 磁珠严禁冷冻，否则可能导致磁珠碎裂，影响mRNA 纯化效果。
2. 所有用于mRNA提取的buffer和耗材都应该是RNase-free，操作过程中应佩戴一次性手套和口罩避免RNase的污染。
3. 磁珠取用前应恢复至室温，且充分混匀。
4. 若总RNA样本降解严重，无法得到高质量的mRNA。
5. 磁珠用量相对于样本量不可过低，否则会导致mRNA回收率低和rRNA残留过高。
6. 磁吸时间不应少于1min，磁吸后吸弃上清液时避免损失磁珠。
7. 洗脱时可能存在磁珠残留，吸取样本时应尽量避免吸入磁珠。
8. 提取到的mRNA最好立即用于RT-PCR。如果需要保存，建议将mRNA从磁珠上洗脱下来，可在洗脱液中添加RNase抑制剂，-80℃冻存。
实验前准备
1. 自配试剂
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试剂名称
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组分
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结合液
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20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA
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洗涤液
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10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA
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洗脱液
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Nuclease-Free Water 或 10 mM Tris-HCl, pH 7.5
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注：所有试剂都使用DEPC水配制，为避免磁珠粘附管壁可在结合液和洗涤液中添加终浓度为0.01%的Tween-20。
2. 自备设备和耗材：磁性分离架，水浴锅或金属浴，冰浴，漩涡振荡器，旋转混合仪，1.5 mL离心管(RNase-free)，微量移液器及吸头(RNase-free)。
3. 将磁珠恢复至室温，且充分重悬。
4. 设置水浴锅或金属浴为65℃。
操作方法
以使用50 μL磁珠，从100 μg总RNA中纯化mRNA为例。可以根据样本用量按比例进行调整。
1. 使用DEPC水将100 μg总RNA的体积调整为100 μL。
注：若总RNA的浓度低于1 μg/μL，可增加样本体积，并调节步骤6的结合液用量和样本体积相同；或者直接使用100 μL样本，以下步骤不变。
2. 将上述总RNA样本于65℃变性处理5 min，立即置于冰浴。
3. 吸取50 μL均匀重悬并恢复至室温的Oligo dT磁珠于1.5 mL离心管(RNase-free)，磁吸，吸弃保存液。
4. 使用100 μL结合液重悬磁珠，磁吸，吸弃上清液。
5. 重复步骤4。
6. 使用100 μL结合液重悬磁珠。
7. 将步骤2中处理好的总RNA样本加入磁悬液中，混匀，室温旋转混合10 min。
8. 磁吸，吸弃上清液。
9. 使用200 μL洗涤液重悬磁珠，磁吸，吸弃上清液。
10. 重复步骤9。
注：使用10 μL移液器吸头尽量吸弃上清液。
11. 加入20-100 μL洗脱液，吹打重悬磁珠，室温混匀5min，磁吸，将纯化的mRNA溶液转移至新的EP管(RNase-free)。
注：65℃-75℃加热洗脱，可增加洗脱效率。
检测分析
- 总RNA中mRNA的含量一般为1%-5%, 可以使用Nanodrop或Qubit测量纯化的mRNA浓度。
- 可以使用RT-qPCR或Agilent 2100 Bioanalyzer及配套的试剂检测rRNA残留情况。
HB230106
