高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021S)

高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒

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RG021S 高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒 100次 518.00元
RG021M 高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒 1000次 2698.00元

碧云天生产的高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(Gaussia Luciferase Reporter Gene Assay Kit),也称高斯萤光素酶检测试剂盒(Gaussia Luciferase Assay Kit),是一种高灵敏度、高信号稳定性的以肠腔素(Coelenterazine)为底物来检测分泌型、非ATP依赖的高斯萤光素酶(Gaussia luciferase,简称Gluc)活性的试剂盒。本试剂盒可以检测不同类型的含有高斯萤光素酶的样品,既可以用于细胞培养上清样品的检测,也可以用于细胞裂解样品或纯化的酶的检测,特别适用于高通量筛选(High-throughput screening)和酶活性的实时研究。

本产品的性能达到甚至优于国外主要同类产品。本产品的性能和用途与Thermo Scientific公司的Pierce™ Gaussia Luciferase Glow Assay Kit基本相同。本产品的检测灵敏度显著优于国外同类产品(Competitor T) (图1A、B),化学发光的信号稳定性与国外同类产品(Competitor T)基本一致(图1C)。本产品的检测效果及与国外同类产品Competitor T的检测效果比较参见图1。

高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021S)

图1. 碧云天高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)和国外同类产品(Competitor T)对转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒pGLuc-Dura-SV40-C (D2770)的293T细胞的检测效果。图A和B分别为本产品(Beyotime)和国外同类产品(Competitor T)对使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒48小时的293T细胞培养上清与细胞裂解液样品(分别使用各自的裂解液进行裂解),进行的化学发光强度的检测效果对比图;图C为本产品(Beyotime)和国外同类产品(Competitor T)对转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒48小时的293T细胞培养上清样品,进行的化学发光稳定性的检测效果对比图;图D为本产品对转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒24、48、72小时的293T细胞培养上清样品(转染时的细胞密度约为50-70%),进行的化学发光强度的检测效果图。实际读数会因细胞种类、高斯萤光素酶表达体系、转染效率、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品发光强度高。对于相同的细胞上清样品,本产品的发光效果比国外同类产品(Competitor T)强约20% (图1A);对于相同的细胞裂解样品,本产品的发光效果是国外同类产品(Competitor T)的10-50倍(图1B)。实测效果可能会因细胞种类、检测环境等的不同有所差异。

本产品发光信号非常稳定。发光信号在10分钟内波动不超过15%,反应30分钟内信号波动不超过30%,信号半衰期大于60分钟,在发光稳定性方面和国外同类产品(Competitor T)基本一致(图1C),特别适用于96或384孔板中高斯萤光素酶活性的大批量测定。

本产品操作简单,读数稳定,检测速度快,完成检测仅需约10分钟。高斯萤光素酶为分泌型萤光素酶,报告基因质粒转染哺乳动物细胞后,大部分高斯萤光素酶可以分泌到细胞外,检测时无需裂解细胞,可直接取上清进行检测,操作非常方便,特别适用于不同时间点的报告基因的检测(图1D)。检测时只需把试剂盒提供的高斯萤光素酶检测底物和高斯萤光素酶检测缓冲液按照1:100比例混合配制成高斯萤光素酶检测工作液,再与5-20微升细胞培养上清或细胞裂解样品混合,反应5-10分钟后即可进行化学发光检测,并且产生的化学发光信号比较稳定,信号半衰期大于60分钟。使用可以测定96孔板的化学发光的多功能酶标仪通常在2分钟内就可以完成一块96孔板的检测。

本产品稳定性好。本试剂盒中的高斯萤光素酶检测缓冲液稳定性非常好,反复冻融10次、4℃保存7天或37℃保存1天对检测效果基本无影响。37℃保存3天检测效果下降不超过5%,37℃保存7天检测效果下降不超过20%。高斯萤光素酶检测底物在4℃保存1周、室温保存1天检测效果下降不超过10%,室温保存3天、37℃保存1天,仍可保留80%以上的检测效果。

本产品使用灵活便捷。本产品不仅适合少量样品的检测,也非常适合大量样品的高通量检测(High-throughput screening);本产品不仅可以用于细胞上清样品的检测,试剂盒同时也提供了高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液,可以用于细胞裂解样品的检测。

本产品兼容性强。本产品兼容各种常见培养液,正常培养液中的酚红、10%以内的胎牛血清或小牛血清、2%以内的DMSO或乙醇、萤光素酶抑制剂等对信号和稳定性基本没有影响,常用的盐类或金属离子在正常浓度下也基本没有影响。

高斯萤光素酶(Gaussia luciferase)是分离于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类(Copepod)动物(Gaussia princeps)的新型萤光素酶。高斯萤光素酶为单条肽链的单体酶,其分子量较小(20kDa),且具有分泌性信号肽,可通过内质网分泌到细胞外。与萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)和天然的海肾萤光素酶(Renilla luciferase)相比,高斯萤光素酶具有以下优点:高斯萤光素酶为自然分泌型萤光素酶,可直接取上清检测,无需裂解细胞,样本的分析和酶活检测只需要几分钟,使得操作更加方便,更适用于报告基因不同时间点的检测和高通量筛选;高斯萤光素酶是可获得的较亮的萤光素酶,它的发光强度是萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的萤光信号的1000多倍,具有更高的检测灵敏度;反应无须ATP,不受ATP影响;高斯萤光素酶的稳定性更高,对温度和pH的耐受性强,可适用于多种培养基[1-3]。

高斯萤光素酶产生的生物萤光是由于腔肠嘧啶的氧化作用,这种反应不需要三磷酸腺苷(ATP)或其它辅助因子。在氧气存在的条件下,高斯萤光素酶可以催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide。在Coelenterazine氧化的过程中,会发出波长为480nm左右的生物萤光(Bioluminescence)。生物萤光可以通过化学发光仪(Luminometer)或液闪测定仪进行测定,萤光强度与高斯蛋白表达量相关,与高斯蛋白表达的启动子活性成正比。通过萤光素和萤光素酶这一生物发光体系,可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游,或把3′-UTR区克隆在luciferase的下游等,构建成报告基因(Reporter gene)质粒,然后转染细胞,用适当药物等处理细胞后,测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。本试剂盒的检测原理参考图2。

高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021S)

图2. 萤火虫萤光素酶的检测原理图。

碧云天同时提供高斯萤光素酶报告基因的空载体质粒和直接使用的报告基因质粒,详见相关产品。

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶和高斯萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和高斯荧光素酶。

对于96孔板,按照检测每个样品需要50μl检测工作液的量,此时本试剂盒S和M包装分别可以进行100次和1000次检测。对于384孔板,按照检测每个样品12.5μl检测工作液的量,此时本试剂盒S和M包装可以进行400次和4000次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
RG021S-1 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 10ml
RG021S-2 高斯萤光素酶检测缓冲液 5ml
RG021S-3 高斯萤光素酶检测底物(100X) 50μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
RG021M-1 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 100ml
RG021M-2 高斯萤光素酶检测缓冲液 50ml
RG021M-3 高斯萤光素酶检测底物(100X) 50μl×10
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,6个月有效。RG021-1 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液和RG021-2 高斯萤光素酶检测缓冲液,-20℃保存一年有效;RG021-3 高斯萤光素酶检测底物(100X),-20℃避光保存6个月有效,-80℃避光保存一年有效。

注意事项:

由于萤光素酶的活性对温度比较敏感,所以反应前细胞样品和高斯萤光素酶检测缓冲液均需平衡至室温后再进行测定。可将检测缓冲液在室温或不超过25℃的水浴中融解并混匀后再与检测底物混合成检测工作液使用。

本试剂盒中的高斯萤光素酶检测缓冲液在反复冻融过程中,可能会导致检测试剂中出现少量沉淀,此时宜平衡至室温,并尽量溶解。如仍有残留的不溶物,可以离心去除后使用,经测试不会影响后续的检测效果。

高斯萤光素酶检测底物(100X)配制在含有高浓度乙醇的溶液中。由于乙醇容易挥发,有时会在初次使用时发现体积明显小于包装体积的情况,此时用无水乙醇把体积补足至包装体积,并混匀后即可使用。

高斯萤光素酶检测工作液宜配制后立即使用。如不能立即使用,-20℃可以保存一周。随着保存时间的延长检测效果会不断下降,因此不可配制成工作液后长期保存。

细胞的培养和转染等可以使用普通的透明96/384孔板,但是使用多功能酶标仪对细胞培养上清或细胞裂解样品进行化学发光的检测时,请使用孔和孔之间不透光的96/384孔白板或黑板。如果使用普通透明的96/384孔板,相邻孔之间会产生相互干扰。推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑或全白96/384孔细胞培养板(FCP966/FCP968/FCP983/FCP985)、白色或黑色透明底96/384孔细胞培养板(FCP963/FCP965/ FCP986/FCP987)。

待测药物的溶剂含量较高时可能会干扰萤光素酶反应,从而影响化学发光信号。可以通过设置含有溶剂的细胞培养液对照孔排除溶剂的干扰。经测试,最终反应体系中DMSO含量在2%以内不会对反应产生影响。

对于同一批样品的检测,必须固定所用样品的体积,使不同样品之间的检测数据具有更好的可比性。

如需更多的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液,可以单独选购碧云天生产的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(RG135),该产品与本试剂盒中的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液的组分完全一致。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.细胞的准备:
使用适合进行化学发光检测的96孔板,每孔接种100μl细胞(如使用384孔板,每孔接种25μl细胞,具体用量视不同类型的384孔板而定),同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照,按照细胞培养和细胞转染的常规方法培养和转染细胞。如有需要,可加入药物处理细胞。继续培养16-72小时。
2.检测试剂的准备:
a.试剂准备:融解高斯萤光素酶检测缓冲液,并平衡至室温。高斯萤光素酶检测底物(100X)放置于冰浴或冰盒上备用。
b.高斯萤光素酶检测工作液的配制:按照检测每个样品需要50μl检测工作液的量,计算所需的高斯萤光素酶检测工作液的量。按照1:100的比例混合适量高斯萤光素酶检测底物(100X)和高斯萤光素酶检测缓冲液,配制成高斯萤光素酶检测工作液。例如,1ml高斯萤光素酶检测缓冲液中加入10μl高斯萤光素酶检测底物(100X)充分混匀后即可配制成约1ml高斯萤光素酶检测工作液。
3.细胞样品的准备:
a.细胞培养上清样品的准备:根据具体实验情况,酌情收集5-200μl细胞培养上清至1.5ml离心管中或收集5-20μl细胞培养上清至检测化学发光用的96孔白板或黑板中,平衡至室温。如有需要,可以在不同的时间点收集培养基,以监测萤光素酶表达的变化。如果不能立即检测,可以将收集好的细胞培养基存放于-20℃。样品在-20℃至少可保存一个月。
b.细胞裂解样品的准备:去除细胞培养液,用PBS洗涤1次,每孔加入高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液100μl,在摇床上以中等速度摇动裂解15分钟。在光学显微镜下检查细胞是否完全溶解,如果溶解不完全,继续摇动裂解15分钟。如果不能立即检测,可以将裂解液样品存放于-20℃,至少可保存一个月。如果细胞最初培养在48孔、24孔、12孔或6孔板中,每孔酌情加入约100-500μl裂解液。
4.萤光素酶检测:
a.取5-20μl细胞培养上清或细胞裂解样品加入96孔白板或黑板。
注1:优先推荐使用5μl样品,样品体积较小时化学发光更加稳定。
注2:对于同一批样品的检测,必须固定所用样品的体积,使不同样品之间的检测数据具有更好的可比性,因为样品体积的大小对于最终的化学发光值会产生一定的影响。
b.每孔加入高斯萤光素酶检测工作液50μl,混匀。
c.室温(约25℃)孵育5-10分钟,使发光信号趋于稳定。
d.使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为0.25-1秒或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。

常见问题:
1.Luminometer和荧光分光光度计有何不同?
荧光分光光度计检测的样品本身不能发光,样品需要由特定波长的激发光激发,然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光,不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能,即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
2.可以进行萤光素酶报告基因检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测?
是。萤光素酶报告基因的检测原理和本试剂盒的原理相同,可以用相同的仪器测定。

参考文献:
1.Tannous BA, Kim DE, Fernandez JL, Weissleder R, Breakefield XO. Mol Ther. 2005. 11(3):435-43.
2.Szent-Gyorgyi C, et al. Proc SPIE. 1999. 3600(1):4-11.
3.Tannous BA. Nat Protoc. 2009. 4:582-591.

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FCP966 BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 80个/盒,320个/箱
FCP968 BeyoGold™全白96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 80个/盒,320个/箱
FCP963 BeyoGold™白色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP965 BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP981 BeyoGold™ 384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP983 BeyoGold™全白384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP985 BeyoGold™全黑384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP986 BeyoGold™白色透明底384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP987 BeyoGold™黑色透明底384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱

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碧云天生产的高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(Gaussia Luciferase Reporter Gene Assay Kit),也称高斯萤光素酶检测试剂盒(Gaussia Luciferase Assay Kit),是一种高灵敏度、高信号稳定性的以肠腔素(Coelenterazine)为底物来检测分泌型、非ATP依赖的高斯萤光素酶(Gaussia luciferase,简称Gluc)活性的试剂盒。本试剂盒可以检测不同类型的含有高斯萤光素酶的样品,既可以用于细胞培养上清样品的检测,也可以用于细胞裂解样品或纯化的酶的检测,特别适用于高通量筛选(High-throughput screening)和酶活性的实时研究。

本产品的性能达到甚至优于国外主要同类产品。本产品的性能和用途与Thermo Scientific公司的Pierce™ Gaussia Luciferase Glow Assay Kit基本相同。本产品的检测灵敏度显著优于国外同类产品(Competitor T) (图1A、B),化学发光的信号稳定性与国外同类产品(Competitor T)基本一致(图1C)。本产品的检测效果及与国外同类产品Competitor T的检测效果比较参见图1。

高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021M)

图1. 碧云天高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)和国外同类产品(Competitor T)对转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒pGLuc-Dura-SV40-C (D2770)的293T细胞的检测效果。图A和B分别为本产品(Beyotime)和国外同类产品(Competitor T)对使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒48小时的293T细胞培养上清与细胞裂解液样品(分别使用各自的裂解液进行裂解),进行的化学发光强度的检测效果对比图;图C为本产品(Beyotime)和国外同类产品(Competitor T)对转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒48小时的293T细胞培养上清样品,进行的化学发光稳定性的检测效果对比图;图D为本产品对转染阳性高斯萤光素酶报告基因质粒24、48、72小时的293T细胞培养上清样品(转染时的细胞密度约为50-70%),进行的化学发光强度的检测效果图。实际读数会因细胞种类、高斯萤光素酶表达体系、转染效率、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品发光强度高。对于相同的细胞上清样品,本产品的发光效果比国外同类产品(Competitor T)强约20% (图1A);对于相同的细胞裂解样品,本产品的发光效果是国外同类产品(Competitor T)的10-50倍(图1B)。实测效果可能会因细胞种类、检测环境等的不同有所差异。

本产品发光信号非常稳定。发光信号在10分钟内波动不超过15%,反应30分钟内信号波动不超过30%,信号半衰期大于60分钟,在发光稳定性方面和国外同类产品(Competitor T)基本一致(图1C),特别适用于96或384孔板中高斯萤光素酶活性的大批量测定。

本产品操作简单,读数稳定,检测速度快,完成检测仅需约10分钟。高斯萤光素酶为分泌型萤光素酶,报告基因质粒转染哺乳动物细胞后,大部分高斯萤光素酶可以分泌到细胞外,检测时无需裂解细胞,可直接取上清进行检测,操作非常方便,特别适用于不同时间点的报告基因的检测(图1D)。检测时只需把试剂盒提供的高斯萤光素酶检测底物和高斯萤光素酶检测缓冲液按照1:100比例混合配制成高斯萤光素酶检测工作液,再与5-20微升细胞培养上清或细胞裂解样品混合,反应5-10分钟后即可进行化学发光检测,并且产生的化学发光信号比较稳定,信号半衰期大于60分钟。使用可以测定96孔板的化学发光的多功能酶标仪通常在2分钟内就可以完成一块96孔板的检测。

本产品稳定性好。本试剂盒中的高斯萤光素酶检测缓冲液稳定性非常好,反复冻融10次、4℃保存7天或37℃保存1天对检测效果基本无影响。37℃保存3天检测效果下降不超过5%,37℃保存7天检测效果下降不超过20%。高斯萤光素酶检测底物在4℃保存1周、室温保存1天检测效果下降不超过10%,室温保存3天、37℃保存1天,仍可保留80%以上的检测效果。

本产品使用灵活便捷。本产品不仅适合少量样品的检测,也非常适合大量样品的高通量检测(High-throughput screening);本产品不仅可以用于细胞上清样品的检测,试剂盒同时也提供了高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液,可以用于细胞裂解样品的检测。

本产品兼容性强。本产品兼容各种常见培养液,正常培养液中的酚红、10%以内的胎牛血清或小牛血清、2%以内的DMSO或乙醇、萤光素酶抑制剂等对信号和稳定性基本没有影响,常用的盐类或金属离子在正常浓度下也基本没有影响。

高斯萤光素酶(Gaussia luciferase)是分离于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类(Copepod)动物(Gaussia princeps)的新型萤光素酶。高斯萤光素酶为单条肽链的单体酶,其分子量较小(20kDa),且具有分泌性信号肽,可通过内质网分泌到细胞外。与萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)和天然的海肾萤光素酶(Renilla luciferase)相比,高斯萤光素酶具有以下优点:高斯萤光素酶为自然分泌型萤光素酶,可直接取上清检测,无需裂解细胞,样本的分析和酶活检测只需要几分钟,使得操作更加方便,更适用于报告基因不同时间点的检测和高通量筛选;高斯萤光素酶是可获得的较亮的萤光素酶,它的发光强度是萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的萤光信号的1000多倍,具有更高的检测灵敏度;反应无须ATP,不受ATP影响;高斯萤光素酶的稳定性更高,对温度和pH的耐受性强,可适用于多种培养基[1-3]。

高斯萤光素酶产生的生物萤光是由于腔肠嘧啶的氧化作用,这种反应不需要三磷酸腺苷(ATP)或其它辅助因子。在氧气存在的条件下,高斯萤光素酶可以催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide。在Coelenterazine氧化的过程中,会发出波长为480nm左右的生物萤光(Bioluminescence)。生物萤光可以通过化学发光仪(Luminometer)或液闪测定仪进行测定,萤光强度与高斯蛋白表达量相关,与高斯蛋白表达的启动子活性成正比。通过萤光素和萤光素酶这一生物发光体系,可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游,或把3′-UTR区克隆在luciferase的下游等,构建成报告基因(Reporter gene)质粒,然后转染细胞,用适当药物等处理细胞后,测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。本试剂盒的检测原理参考图2。

高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021M)

图2. 萤火虫萤光素酶的检测原理图。

碧云天同时提供高斯萤光素酶报告基因的空载体质粒和直接使用的报告基因质粒,详见相关产品。

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶和高斯萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和高斯荧光素酶。

对于96孔板,按照检测每个样品需要50μl检测工作液的量,此时本试剂盒S和M包装分别可以进行100次和1000次检测。对于384孔板,按照检测每个样品12.5μl检测工作液的量,此时本试剂盒S和M包装可以进行400次和4000次检测。

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RG021S-1 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 10ml
RG021S-2 高斯萤光素酶检测缓冲液 5ml
RG021S-3 高斯萤光素酶检测底物(100X) 50μl
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产品编号 产品名称 包装
RG021M-1 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 100ml
RG021M-2 高斯萤光素酶检测缓冲液 50ml
RG021M-3 高斯萤光素酶检测底物(100X) 50μl×10
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保存条件:

-20℃保存,6个月有效。RG021-1 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液和RG021-2 高斯萤光素酶检测缓冲液,-20℃保存一年有效;RG021-3 高斯萤光素酶检测底物(100X),-20℃避光保存6个月有效,-80℃避光保存一年有效。

注意事项:

由于萤光素酶的活性对温度比较敏感,所以反应前细胞样品和高斯萤光素酶检测缓冲液均需平衡至室温后再进行测定。可将检测缓冲液在室温或不超过25℃的水浴中融解并混匀后再与检测底物混合成检测工作液使用。

本试剂盒中的高斯萤光素酶检测缓冲液在反复冻融过程中,可能会导致检测试剂中出现少量沉淀,此时宜平衡至室温,并尽量溶解。如仍有残留的不溶物,可以离心去除后使用,经测试不会影响后续的检测效果。

高斯萤光素酶检测底物(100X)配制在含有高浓度乙醇的溶液中。由于乙醇容易挥发,有时会在初次使用时发现体积明显小于包装体积的情况,此时用无水乙醇把体积补足至包装体积,并混匀后即可使用。

高斯萤光素酶检测工作液宜配制后立即使用。如不能立即使用,-20℃可以保存一周。随着保存时间的延长检测效果会不断下降,因此不可配制成工作液后长期保存。

细胞的培养和转染等可以使用普通的透明96/384孔板,但是使用多功能酶标仪对细胞培养上清或细胞裂解样品进行化学发光的检测时,请使用孔和孔之间不透光的96/384孔白板或黑板。如果使用普通透明的96/384孔板,相邻孔之间会产生相互干扰。推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑或全白96/384孔细胞培养板(FCP966/FCP968/FCP983/FCP985)、白色或黑色透明底96/384孔细胞培养板(FCP963/FCP965/ FCP986/FCP987)。

待测药物的溶剂含量较高时可能会干扰萤光素酶反应,从而影响化学发光信号。可以通过设置含有溶剂的细胞培养液对照孔排除溶剂的干扰。经测试,最终反应体系中DMSO含量在2%以内不会对反应产生影响。

对于同一批样品的检测,必须固定所用样品的体积,使不同样品之间的检测数据具有更好的可比性。

如需更多的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液,可以单独选购碧云天生产的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(RG135),该产品与本试剂盒中的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液的组分完全一致。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.细胞的准备:
使用适合进行化学发光检测的96孔板,每孔接种100μl细胞(如使用384孔板,每孔接种25μl细胞,具体用量视不同类型的384孔板而定),同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照,按照细胞培养和细胞转染的常规方法培养和转染细胞。如有需要,可加入药物处理细胞。继续培养16-72小时。
2.检测试剂的准备:
a.试剂准备:融解高斯萤光素酶检测缓冲液,并平衡至室温。高斯萤光素酶检测底物(100X)放置于冰浴或冰盒上备用。
b.高斯萤光素酶检测工作液的配制:按照检测每个样品需要50μl检测工作液的量,计算所需的高斯萤光素酶检测工作液的量。按照1:100的比例混合适量高斯萤光素酶检测底物(100X)和高斯萤光素酶检测缓冲液,配制成高斯萤光素酶检测工作液。例如,1ml高斯萤光素酶检测缓冲液中加入10μl高斯萤光素酶检测底物(100X)充分混匀后即可配制成约1ml高斯萤光素酶检测工作液。
3.细胞样品的准备:
a.细胞培养上清样品的准备:根据具体实验情况,酌情收集5-200μl细胞培养上清至1.5ml离心管中或收集5-20μl细胞培养上清至检测化学发光用的96孔白板或黑板中,平衡至室温。如有需要,可以在不同的时间点收集培养基,以监测萤光素酶表达的变化。如果不能立即检测,可以将收集好的细胞培养基存放于-20℃。样品在-20℃至少可保存一个月。
b.细胞裂解样品的准备:去除细胞培养液,用PBS洗涤1次,每孔加入高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液100μl,在摇床上以中等速度摇动裂解15分钟。在光学显微镜下检查细胞是否完全溶解,如果溶解不完全,继续摇动裂解15分钟。如果不能立即检测,可以将裂解液样品存放于-20℃,至少可保存一个月。如果细胞最初培养在48孔、24孔、12孔或6孔板中,每孔酌情加入约100-500μl裂解液。
4.萤光素酶检测:
a.取5-20μl细胞培养上清或细胞裂解样品加入96孔白板或黑板。
注1:优先推荐使用5μl样品,样品体积较小时化学发光更加稳定。
注2:对于同一批样品的检测,必须固定所用样品的体积,使不同样品之间的检测数据具有更好的可比性,因为样品体积的大小对于最终的化学发光值会产生一定的影响。
b.每孔加入高斯萤光素酶检测工作液50μl,混匀。
c.室温(约25℃)孵育5-10分钟,使发光信号趋于稳定。
d.使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为0.25-1秒或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。

常见问题:
1.Luminometer和荧光分光光度计有何不同?
荧光分光光度计检测的样品本身不能发光,样品需要由特定波长的激发光激发,然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光,不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能,即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
2.可以进行萤光素酶报告基因检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测?
是。萤光素酶报告基因的检测原理和本试剂盒的原理相同,可以用相同的仪器测定。

参考文献:
1.Tannous BA, Kim DE, Fernandez JL, Weissleder R, Breakefield XO. Mol Ther. 2005. 11(3):435-43.
2.Szent-Gyorgyi C, et al. Proc SPIE. 1999. 3600(1):4-11.
3.Tannous BA. Nat Protoc. 2009. 4:582-591.

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D2181 pISRE-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2209 pNFκB-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2225 pp53-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2261 pSTAT3-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2204 pNFκB-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2764 pGLuc-Dura-SV40-N (报告基因质粒) 1/100µg
D2770 pGLuc-Dura-SV40-C (报告基因质粒) 1/100µg
FCP966 BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 80个/盒,320个/箱
FCP968 BeyoGold™全白96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 80个/盒,320个/箱
FCP963 BeyoGold™白色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP965 BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP981 BeyoGold™ 384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP983 BeyoGold™全白384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP985 BeyoGold™全黑384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP986 BeyoGold™白色透明底384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
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高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021M)
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萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型)(RG009M)

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型)

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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
RG009S 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) 100次 478.00元
RG009M 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) 1000次 2268.00元

碧云天生产的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) (Enhanced Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是一种以萤光素(luciferin)为底物高灵敏度检测萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)活性的试剂盒。

本产品是萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II (增强型) (RG010)的不同包装版本,两者的检测效果完全一致。本产品,即RG009为即用型液体,其优点是无需配制即可直接使用,但需要-80℃保存,如果在-20℃保存时间较长后检测效果会逐渐下降。萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II (增强型),即RG010,为RG009的冻干粉版本,优点是在-20℃保存非常稳定,缺点是使用前需要使用提供的缓冲液充分溶解底物冻干粉后才能使用。

本产品的性能达到国外主要同类产品同等水平。本产品的性能和用途与Promega公司的Luciferase Assay System基本相同。本产品(RG009)与国外同类产品(Competitor P)的检测效果比较参见图1,本产品的发光强度与国外同类产品(Competitor P)相近或略优(图1A),发光信号稳定性与国外同类产品(Competitor P)基本一致(图1B)。

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型)(RG009M)

图1. 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) (RG009)的检测效果对比图。图中所示为本产品和国外同类产品(Competitor P)对转染阳性萤火虫萤光素酶报告基因质粒的HeLa细胞裂解样品的检测效果。图A为化学发光强度的检测效果对比图,图B为化学发光稳定性的检测效果对比图。实际读数会因细胞种类、转染效率、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品发光强度高。对于相同的细胞样品,本产品的发光强度可以达到甚至略优于国外同类产品(图1A),特别适用于Firefly luciferase表达水平低的样品检测。如果样品中萤火虫萤光素酶的表达水平较高,或者样品数量较多、对发光信号的稳定性要求较高,也可以使用发光强度和灵敏度稍低,但发光信号更稳定的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG005/RG006/RG007)。

本产品操作简单,检测速度快,从样品制备到完成检测仅需约20分钟。本试剂盒中提供的萤火虫萤光素酶检测试剂为即用型试剂,只需将100微升萤火虫萤光素酶检测试剂与20-100微升裂解制备的细胞样品混合后即可立即进行化学发光检测。并且发光信号比较稳定,信号半衰期约10分钟。

本产品稳定性好。本试剂盒中的萤火虫萤光素酶检测试剂的稳定性非常好,反复冻融5次对检测效果无明显影响,反复冻融10次检测效果下降不超过10%。在4℃条件下,保存3天检测效果下降不超过20%,保存5天检测效果下降不超过30%,保存7天仍可保留60%以上的检测效果。在室温保存1天可保留70%以上的检测效果,室温保存3天可保留60%以上的检测效果,37℃保存1天可保留50%以上的检测效果。萤火虫萤光素酶检测试剂即使仅保留约50%的检测效果,仍可以满足各种常规检测的要求。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白,在ATP、镁离子和氧气存在的条件下,可以催化luciferin氧化成oxyluciferin。在luciferin氧化的过程中,会发出生物萤光(bioluminescence)。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定[1]。本试剂盒的检测原理参考图2。

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型)(RG009M)

图2. 萤火虫萤光素酶的检测原理图。

通过萤光素和萤光素酶这一生物发光体系,可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游,或把3′-UTR区克隆在luciferase的下游等,构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞,用适当药物等处理细胞后裂解细胞,测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用[2]。

关于碧云天萤光素酶报告基因检测试剂盒相关产品的比较和选择,请参考碧云天的相关网页:
http://www.beyotime.com/support/luciferase-reporter-gene-assay.htm

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。

萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm (centered around 560nm)。

本试剂盒RG009S和RG009M分别可以测定100个和1000个样品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
RG009S-1 报告基因细胞裂解液 60ml
RG009S-2 萤火虫萤光素酶检测试剂 10ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
RG009M-1 报告基因细胞裂解液 RG009S-1×10
RG009M-2 萤火虫萤光素酶检测试剂 RG009S-2×10
说明书 1份
保存条件:

报告基因细胞裂解液4℃保存3个月有效,-20℃保存一年有效,-80℃可以长期保存;萤火虫萤光素酶检测试剂-80℃避光保存,至少一年有效;-20℃避光保存,推荐3-6个月内使用。

注意事项:

萤火虫萤光素酶检测试剂在-20℃保存其检测效果会逐渐下降,保存半年后其发光效果会降低约50%。因此,本产品如果保存于-20℃,推荐在3-6个月内使用。如果订购后可能放置较长时间后再使用,推荐订购在-20℃保存非常稳定的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II (增强型) (RG010)。

为取得最佳测定效果,在用单管的化学发光仪测定时,样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内,例如30秒内;使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时,宜先把样品全部加好,然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。

由于萤光素酶的活性对温度比较敏感,所以反应前样品和检测试剂均需达到室温后再进行测定。可将萤火虫萤光素酶检测试剂在室温或不超过25℃的水浴中融解并混匀后使用。

尽管经测试萤火虫萤光素酶检测试剂反复冻融5次对其检测效果无明显影响,为保证萤光素酶检测试剂的稳定性、取得良好的使用效果,第一次解冻后可以采取适当分装后避光保存的方法,以避免反复冻融和长时间暴露于室温。

检测时需使用白色或黑色的96孔板。如果使用普通透明的96孔板,相邻孔之间会产生相互干扰。推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™全白96孔细胞培养板(FCP968)。

样品和测定试剂混合后,必须等待1-2秒,再进行测定。测定时间通常为10秒,根据情况也可以测定更长或更短时间,但是同一批样品宜使用相同的测定时间。

为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差,可以同时转入海肾萤光素酶(Renilla luciferase)的报告基因质粒作为内参,采用碧云天的双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG027/RG028)或双萤光素酶报告基因检测试剂盒II (RG029)进行检测;也可以同时转入β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)报告基因质粒作为内参,然后采用碧云天生产的β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒(RG0036)进行检测。采用本试剂盒中的报告基因细胞裂解液裂解获得的样品可以直接用于β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒(RG0036)的检测。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 裂解细胞:将报告基因细胞裂解液充分混匀后,按如下方式加入报告基因细胞裂解液,充分裂解细胞。
a. 对于贴壁细胞:吸尽细胞培养液后,参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液;对于悬浮细胞:离心去上清后,参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

器皿类型 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板
报告基因细胞裂解液(μl/孔) 100 150 200 300 500

注:如果萤光素酶的表达水平比较低,可以尝试使用更少的裂解液,例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。
b. 充分裂解后,10,000-15,000×g离心3-5分钟,取上清用于测定。
注:细胞裂解后可立即测定萤光素酶,也可以先冻存,待以后再测定。冻存样品需融解,并达到室温后再进行测定。
2. 融解萤火虫萤光素酶检测试剂,并达到室温。
3. 按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪,可以将测定间隔设为2秒,测定时间设为10秒,或者根据仪器设备的要求并根据实验需要设置适当的间隔时间和测定时间。
4. 每个样品测定时,取样品20-100微升(如果样品量足够,请加入100微升;如果样品量不足可以适当减少用量,但同批样品的使用量宜保持一致),取等体积的报告基因细胞裂解液作为空白对照。
5. 各孔加入100微升萤火虫萤光素酶检测试剂,用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU (relative light unit)。本试剂盒的检测效果以及与同类竞争产品的检测效果比较可以参考图1。

常见问题:
1. Luminometer和荧光分光光度计有何不同?
荧光分光光度计检测的样品本身不能发光,样品需要由特定波长的激发光激发,然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光,不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能,即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
2. 可以进行ATP化学发光检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测?
是。ATP化学发光的检测原理和本试剂盒的原理相同,可以用相同的仪器测定。

参考文献:
1. J R de Wet, K V Wood, M DeLuca, D R Helinski, and S Subramani. Mol Cell Biol. 1987. 7:725-37.
2. E Schenborn, D Groskreutz. Mol Biotechnol. 1999. 13:29-44.

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高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(RG135S)

高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液

产品编号: RG135S

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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
RG135S 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 10ml 48.00元
RG135M 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 100ml 268.00元

碧云天生产的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(Gaussia Luciferase Reporter Gene Assay Cell Lysis Buffer),也称高斯萤光素酶检测细胞裂解液(Gaussia Luciferase Assay Cell Lysis Buffer)。本产品裂解后的细胞样品,主要用于高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)和Gaussia-Lumi™高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG072)的检测。本产品制备的样品不适合用于萤火虫萤光素酶报告基因或海肾萤光素酶报告基因的检测。

使用高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)时,如果需要更多的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液,可以使用本产品。使用Gaussia-Lumi™高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG072)时,如果希望用于检测细胞裂解样品,也可以使用本产品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
RG135S 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 10ml
RG135M 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 100ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,一年有效。

注意事项:

本产品裂解后的样品不适合直接用于萤火虫萤光素酶报告基因或海肾萤光素酶报告基因的检测。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 细胞的准备:
接种细胞,同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照,按照细胞培养的常规方法培养细胞。如有需要,可用质粒转染细胞或用病毒感染细胞,或加入药物处理细胞。根据具体情况,继续培养16-72小时。
2. 裂解液的准备:
融解高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液。
3. 细胞裂解液的制备:
去除细胞培养液,用PBS洗涤1次,每孔加入高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(96孔板每孔加入100μl,48孔、24孔、12孔或6孔板,每孔酌情加入约100-500μl裂解液),在摇床上以中等速度摇动裂解15分钟。在光学显微镜下检查细胞是否完全溶解,如果溶解不完全,继续摇动裂解15分钟。后续就可以使用高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)或Gaussia-Lumi™高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG072)进行报告基因的检测了。如果不能立即检测,可以将裂解液样品存放于-20℃,至少可保存一个月。

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D2104 pGLuc-Dura-TA (报告基因质粒) 1/100µg
D2107 pGLuc-Dura-miR (报告基因质粒) 1/100µg
D2114 pARE-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2181 pISRE-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2209 pNFκB-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2225 pp53-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2261 pSTAT3-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2204 pNFκB-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2764 pGLuc-Dura-SV40-N (报告基因质粒) 1/100µg
D2770 pGLuc-Dura-SV40-C (报告基因质粒) 1/100µg
FCP966 BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 80个/盒,320个/箱
FCP968 BeyoGold™全白96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 80个/盒,320个/箱
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FCP983 BeyoGold™全白384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP985 BeyoGold™全黑384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
FCP986 BeyoGold™白色透明底384孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) 8个/盒,48个/箱
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高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(RG135S)
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RG135S 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 10ml 48.00元
RG135M 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 100ml 268.00元

碧云天生产的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(Gaussia Luciferase Reporter Gene Assay Cell Lysis Buffer),也称高斯萤光素酶检测细胞裂解液(Gaussia Luciferase Assay Cell Lysis Buffer)。本产品裂解后的细胞样品,主要用于高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)和Gaussia-Lumi™高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG072)的检测。本产品制备的样品不适合用于萤火虫萤光素酶报告基因或海肾萤光素酶报告基因的检测。

使用高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)时,如果需要更多的高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液,可以使用本产品。使用Gaussia-Lumi™高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG072)时,如果希望用于检测细胞裂解样品,也可以使用本产品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
RG135S 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 10ml
RG135M 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 100ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,一年有效。

注意事项:

本产品裂解后的样品不适合直接用于萤火虫萤光素酶报告基因或海肾萤光素酶报告基因的检测。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 细胞的准备:
接种细胞,同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照,按照细胞培养的常规方法培养细胞。如有需要,可用质粒转染细胞或用病毒感染细胞,或加入药物处理细胞。根据具体情况,继续培养16-72小时。
2. 裂解液的准备:
融解高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液。
3. 细胞裂解液的制备:
去除细胞培养液,用PBS洗涤1次,每孔加入高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液(96孔板每孔加入100μl,48孔、24孔、12孔或6孔板,每孔酌情加入约100-500μl裂解液),在摇床上以中等速度摇动裂解15分钟。在光学显微镜下检查细胞是否完全溶解,如果溶解不完全,继续摇动裂解15分钟。后续就可以使用高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG021)或Gaussia-Lumi™高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG072)进行报告基因的检测了。如果不能立即检测,可以将裂解液样品存放于-20℃,至少可保存一个月。

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RG021 高斯萤光素酶报告基因检测试剂盒 100/1000次
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RG135 高斯萤光素酶报告基因细胞裂解液 10/100ml
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D2100 pGLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2103 pGLuc-TA (报告基因质粒) 1/100µg
D2104 pGLuc-Dura-TA (报告基因质粒) 1/100µg
D2107 pGLuc-Dura-miR (报告基因质粒) 1/100µg
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D2181 pISRE-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
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D2225 pp53-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2261 pSTAT3-TA-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2204 pNFκB-GLuc-Dura (报告基因质粒) 1/100µg
D2764 pGLuc-Dura-SV40-N (报告基因质粒) 1/100µg
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萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG007M)

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II

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RG007S 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II 100次 427.00元
RG007M 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II 1000次 2399.00元

碧云天生产的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II (Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit II),是一种以萤光素(luciferin)为底物高信号稳定性检测萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)活性的试剂盒。

本产品是萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒 (RG005/RG006)的不同包装版本,两者的检测效果完全一致。萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒,即RG005/RG006为即用型液体,其优点是无需配制即可直接使用,但需要-80℃保存,如果在-20℃保存时间较长后检测效果会逐渐下降。本产品,即RG007,为RG005/RG006的冻干粉版本,优点是在-20℃保存非常稳定,缺点是使用前需要使用提供的缓冲液充分溶解底物冻干粉后才能使用。

本产品的性能基本达到甚至在某些方面优于国外主要同类产品。本产品的用途与碧云天的同类产品萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) (Enhanced Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit)及Promega公司的Luciferase Assay System基本相同。本产品(RG005/RG006)的化学发光信号稳定性显著优于萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) (RG009)及国外同类产品(Competitor P) (图1B),发光强度也可以达到萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) (RG009)及国外同类产品(Competitor P)的约40% (图1A)。本产品与RG009及国外同类产品(Competitor P)的检测效果比较参见图1。

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG007M)

图1. 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II (RG007)的检测效果对比图。萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II (RG007)与碧云天生产的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG005/RG006)的检测效果完全一致。图中所示为本产品,相当于RG005/RG006,和碧云天的同类产品萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) (RG009)及国外同类产品(Competitor P)对转染阳性萤火虫萤光素酶报告基因质粒的HeLa细胞裂解样品的检测效果。图A为化学发光强度的检测效果对比图,图B为化学发光稳定性的检测效果对比图。实际读数会因细胞种类、转染效率、报告基因质粒、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品发光信号稳定。本产品的发光信号稳定性相对比较好,1分钟内信号基本保持稳定,信号变动不超过2%,3分钟内的信号变动不超过5%,5分钟内信号波动不超过10%,信号半衰期约40分钟,在发光稳定性方面显著优于RG009和国外同类产品Competitor P (图1B),特别适用于待测样品数量较多的96孔板中进行萤火虫萤光素酶活性的多孔测定。

本产品发光强度高。对于相同的细胞样品,本产品的发光效果可以达到RG009和国外同类产品的约40%,虽然低于RG009和国外同类产品(Competitor P),但是发光强度相对已经非常高,可以满足各种常规检测。如果样品中萤火虫萤光素酶的表达水平非常低时,推荐使用发光强度和灵敏度更高的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(增强型) (RG009/RG010)。

本产品操作简单,读数稳定,检测速度快,从样品制备到完成检测仅需约20分钟。只需用试剂盒中提供的萤火虫萤光素酶检测缓冲液把检测底物(冻干粉)充分溶解后配制成萤火虫萤光素酶检测试剂II,再取100微升萤火虫萤光素酶检测试剂II与20-100微升裂解制备的细胞样品混合后即可立即进行化学发光检测。并且发光信号比较稳定,通常5分钟内信号下降不超过10%。

本产品稳定性好。本试剂盒在-20℃可以长期保存,配制成萤火虫萤光素酶检测试剂II后的稳定性也非常好,反复冻融5次对检测效果无明显影响,反复冻融10次检测效果下降不超过10%。萤火虫萤光素酶检测试剂II在4℃条件下,保存3天检测效果下降不超过20%,保存5天检测效果下降不超过30%,保存7天仍可保留60%以上的检测效果。在室温保存1天可保留70%以上的检测效果,室温保存3天可保留60%以上的检测效果,37℃保存1天可保留50%以上的检测效果。萤火虫萤光素酶检测试剂II即使仅保留约50%的检测效果,仍可以满足各种常规检测的要求。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白,在ATP、镁离子和氧气存在的条件下,可以催化luciferin氧化成oxyluciferin。在luciferin氧化的过程中,会发出生物萤光(bioluminescence)。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定[1]。本试剂盒的检测原理参考图2。

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG007M)

图2. 萤火虫萤光素酶的检测原理图。

通过萤光素和萤光素酶这一生物发光体系,可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游,或把3′-UTR区克隆在luciferase的下游等,构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞,用适当药物等处理细胞后裂解细胞,测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用[2]。

关于碧云天萤光素酶报告基因检测试剂盒相关产品的比较和选择,请参考碧云天的相关网页:
http://www.beyotime.com/support/luciferase-reporter-gene-assay.htm

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。

萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm (centered around 560nm)。

本试剂盒RG007S和RG007M分别可以测定100个和1000个样品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
RG007S-1 报告基因细胞裂解液 60ml
RG007S-2 萤火虫萤光素酶检测缓冲液 10ml
RG007S-3 萤火虫萤光素酶检测底物 1瓶
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
RG007M-1 报告基因细胞裂解液 RG007S-1×10
RG007M-2 萤火虫萤光素酶检测缓冲液 RG007S-2×10
RG007M-3 萤火虫萤光素酶检测底物 RG007S-3×10
说明书 1份
保存条件:

-20℃避光保存,至少一年有效。萤火虫萤光素酶检测缓冲液和检测底物混合配制成的萤火虫萤光素酶检测试剂II,-80℃避光保存,至少一年有效;-20℃避光保存,推荐3-6个月内使用。

注意事项:

对于订购后可能放置较长时间后再使用的,或者对于检测结果的精度要求特别高的,推荐订购萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II (RG007);对于订购后短期内使用完毕的,推荐订购使用更加便捷的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG005/RG006)。

为取得最佳测定效果,在用单管的化学发光仪测定时,样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内,例如30秒内;使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时,宜先把样品全部加好,然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂II。

由于萤光素酶的活性对温度比较敏感,所以反应前样品和检测试剂均需达到室温后再进行测定。可将萤火虫萤光素酶检测缓冲液在室温或不超过25℃的水浴中融解并混匀后再与检测底物混合成检测试剂使用。

尽管经测试萤火虫萤光素酶检测缓冲液和检测底物混合后配制成的萤火虫萤光素酶检测试剂II反复冻融5次对其检测效果无明显影响,为保证萤光素酶检测试剂的稳定性、取得良好的使用效果,建议现用现配。没有用完的检测试剂可以采取适当分装后避光保存的方法,以避免反复冻融和长时间暴露于室温。

检测时需使用白色或黑色的96孔板。如果使用普通透明的96孔板,相邻孔之间会产生相互干扰。推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™全白96孔细胞培养板(FCP968)。

样品和测定试剂混合后,必须等待1-2秒,再进行测定。测定时间通常为10秒,根据情况也可以测定更长或更短时间,但是同一批样品宜使用相同的测定时间。

为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差,可以同时转入海肾萤光素酶(Renilla luciferase)的报告基因质粒作为内参,采用碧云天的双萤光素酶报告基因检测试剂盒 (RG027/RG028)或双萤光素酶报告基因检测试剂盒II (RG029)进行检测;也可以同时转入β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)报告基因质粒作为内参,然后采用碧云天生产的β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒(RG0036)进行检测。采用本试剂盒中的报告基因细胞裂解液裂解获得的样品可以直接用于β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒(RG0036)的检测。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 裂解细胞:将报告基因细胞裂解液充分混匀后,按如下方式加入报告基因细胞裂解液,充分裂解细胞。
a. 对于贴壁细胞:吸尽细胞培养液后,参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液;对于悬浮细胞:离心去上清后,参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

器皿类型 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板
报告基因细胞裂解液(μl/孔) 100 150 200 300 500

注:如果萤光素酶的表达水平比较低,可以尝试使用更少的裂解液,例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。
b. 充分裂解后,10,000-15,000×g离心3-5分钟,取上清用于测定。
注:细胞裂解后可立即测定萤光素酶,也可以先冻存,待以后再测定。冻存样品需融解,并达到室温后再进行测定。
2. 准备检测试剂:融解冻存的萤火虫萤光素酶检测缓冲液,将检测缓冲液全部转移至检测底物瓶中,旋紧瓶盖后适当颠倒混匀,当检测底物全部溶解并混匀后即为萤火虫萤光素酶检测试剂II。按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量,取适量萤火虫萤光素酶检测试剂II,平衡至室温。注:冻干粉状的萤火虫萤光素酶检测底物可能会有少量粘附在瓶盖和瓶口,旋开瓶盖前可以拿起瓶子用瓶底并轻轻敲击桌面,使粉末尽量掉落至瓶底,然后再轻轻旋开瓶盖,并注意不要损失冻干粉。
3. 按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪,可以将测定间隔设为2秒,测定时间设为10秒,或者根据仪器设备的要求并根据实验需要设置适当的间隔时间和测定时间。
4. 每个样品测定时,取样品20-100微升(如果样品量足够,请加入100微升;如果样品量不足可以适当减少用量,但同批样品的使用量宜保持一致),取等体积的报告基因细胞裂解液作为空白对照。
5. 各孔加入100微升萤火虫萤光素酶检测试剂II,用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU (relative light unit)。本试剂盒的检测效果以及与同类竞争产品的检测效果比较可以参考图1。

常见问题:
1. Luminometer和荧光分光光度计有何不同?
荧光分光光度计检测的样品本身不能发光,样品需要由特定波长的激发光激发,然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光,不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能,即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
2. 可以进行ATP化学发光检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测?
是。ATP化学发光的检测原理和本试剂盒的原理相同,可以用相同的仪器测定。

参考文献:
1. J R de Wet, K V Wood, M DeLuca, D R Helinski, and S Subramani. Mol Cell Biol. 1987. 7:725-37.
2. E Schenborn, D Groskreutz. Mol Biotechnol. 1999. 13:29-44.

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RG132S/M 双萤光素酶报告基因细胞裂解液 10/100ml

萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG007M)
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双萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG029M)

双萤光素酶报告基因检测试剂盒II

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RG029S 双萤光素酶报告基因检测试剂盒II 100次 856.00元
RG029M 双萤光素酶报告基因检测试剂盒II 1000次 5385.00元

碧云天生产的双萤光素酶报告基因检测试剂盒II (Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit II),是先以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase),后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase),并且在后续加入海肾萤光素酶底物时,同时加入抑制萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的物质,该物质可以淬灭约99.9%以上的萤火虫萤光素酶信号,使后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性,从而实现双萤光素酶报告基因检测。

本产品是双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG027/RG028)的不同包装版本,两者的检测效果完全一致。双萤光素酶报告基因检测试剂盒,即RG027/RG028中的萤火虫萤光素酶检测试剂为即用型液体,其优点是无需配制即可直接使用,但需要-80℃保存,如果在-20℃保存时间较长后检测效果会逐渐下降。本产品,即RG029,为RG027/RG028的冻干粉版本,优点是在-20℃保存非常稳定,缺点是使用前需要使用提供的萤火虫萤光素酶检测缓冲液充分溶解底物冻干粉后才能使用。

本产品的性能总体优于国外主要同类产品。本产品的用途与Promega公司的Dual-Luciferase® Reporter Assay System基本相同。本产品的检测灵敏度显著优于国外同类产品(Competitor P),萤火虫萤光素酶的信号强度比国外同类产品(Competitor P)提高了约40%,海肾萤光素酶的信号强度比同类产品(Competitor P)提高了约25% (图1A、1B);萤火虫萤光素酶的化学发光的信号稳定性显著优于国外同类产品(Competitor P) (图1C),海肾萤光素酶的化学发光的信号稳定性与国外同类产品(Competitor P)基本一致或略优(图1D);本产品的海肾萤光素酶检测工作液对萤火虫萤光素酶的淬灭效果较国外同类产品(Competitor P)更佳(图1A)。本产品与国外同类产品(Competitor P)的检测效果比较参见图1。

双萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG029M)

图1. 双萤光素酶报告基因检测试剂盒II (RG029)的检测效果对比图。本试剂盒与碧云天生产的双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG027/RG028)的检测效果完全一致。图中所示为本产品和国外同类产品(Competitor P)对共转染阳性萤火虫萤光素酶报告基因质粒和海肾萤光素酶报告基因质粒的HeLa细胞裂解样品的检测效果。图A为整体检测效果对比图,图B为萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的化学发光强度的检测效果对比图,图C为萤火虫萤光素酶的化学发光稳定性的检测效果对比图,图D为海肾萤光素酶的化学发光稳定性的检测效果对比图。实际读数会因细胞种类、转染效率、报告基因质粒、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品发光强度高。对于相同的样品,萤火虫萤光素酶的检测,本产品的发光效果比国外同类产品(Competitor P)高约30-45%,海肾萤光素酶的检测,本产品的发光效果比国外同类产品(Competitor P)高约20-30% (图1A、B)。

本产品操作简单,读数稳定,检测速度快,从样品制备到完成整个检测过程仅需约25分钟。只需用试剂盒中提供的萤火虫萤光素酶检测缓冲液把检测底物(冻干粉)充分溶解后配制成萤火虫萤光素酶检测试剂II,海肾萤光素酶检测底物和海肾萤光素酶检测缓冲液按照1:100的比例混合即可配制成海肾萤光素酶检测工作液,再各取100微升先后与20-100微升裂解制备的细胞样品混合后即可立即进行化学发光检测。并且化学发光比较稳定,萤火虫萤光素酶的信号半衰期约15分钟,海肾萤光素酶的信号半衰期约200秒。

本产品的海肾萤光素酶检测工作液对萤火虫萤光素酶的淬灭效果好。本试剂盒中的海肾萤光素酶检缓冲液和海肾萤光素酶检测底物配制的海肾萤光素酶检测工作液含有抑制萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的物质,海肾萤光素酶检测试剂加入后通过简单的混匀,就可以抑制99.9%以上的萤火虫萤光素酶催化的发光信号,大大提高了后续海肾萤光素酶活性检测的精准性。

本产品稳定性好。本试剂盒在-20℃可以长期保存,配制成萤火虫萤光素酶检测试剂II后的稳定性及海肾萤光素酶检测缓冲液和海肾萤光素酶检测底物(100X)的稳定性均较好。萤火虫萤光素酶检测试剂II反复冻融5次对检测效果基本无影响,反复冻融10次检测效果下降不超过10%;4℃条件下,保存3天检测效果下降不超过20%,保存5天检测效果下降不超过30%,保存7天仍可保留60%以上的检测效果;室温保存1天可保留70%以上的检测效果,保存3天可保留60%以上的检测效果;37℃保存1天可保留50%以上的检测效果。海肾萤光素酶检测缓冲液反复冻融10次、4℃或室温保存3天对检测效果基本无影响,37℃保存1天对检测效果的影响不超过5%。海肾萤光素酶检测底物(100X)在4℃保存1周、室温保存1天检测效果下降不到10%,室温保存3天、37℃保存1天,仍可保留80%以上的活力。

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白,在ATP、镁离子和氧气存在的条件下,可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物萤光(bioluminescence) [1]。海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白,在氧气存在的条件下,可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide,在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定[2]。本试剂盒的检测原理参考图2.

双萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG029M) 双萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG029M)

图2. 双萤光素酶的检测原理图。

通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系,可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游,或把3′-UTR区克隆在luciferase的下游等,构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞,用适当药物等处理细胞后裂解细胞,测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。Renilla luciferase相对更多地被用作转染效率的内参,以消除细胞数量和转染效率的差异[3]。

关于碧云天萤光素酶报告基因检测试剂盒相关产品的比较和选择,请参考碧云天的相关网页:
http://www.beyotime.com/support/luciferase-reporter-gene-assay.htm

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。

萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。

本试剂盒RG029S和RG029M分别可以测定100个和1000个样品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
RG029S-1 报告基因细胞裂解液 60ml
RG029S-2 萤火虫萤光素酶检测缓冲液 10ml
RG029S-3 萤火虫萤光素酶检测底物 1瓶
RG029S-4 海肾萤光素酶检测缓冲液 10ml
RG029S-5 海肾萤光素酶检测底物(100X) 100µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
RG029M-1 报告基因细胞裂解液 RG029S-1×10
RG029M-2 萤火虫萤光素酶检测缓冲液 RG029S-2×10
RG029M-3 萤火虫萤光素酶检测底物 RG029S-3×10
RG029M-4 海肾萤光素酶检测缓冲液 RG029S-4×10
RG029M-5 海肾萤光素酶检测底物(100X) RG029S-5×10
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,一年有效。萤火虫萤光素酶检测底物和海肾萤光素酶检测底物(100X)须-20℃避光保存。萤火虫萤光素酶检测缓冲液和检测底物混合后配制成的萤火虫萤光素酶检测试剂II,-80℃避光保存,至少一年有效;-20℃避光保存,推荐3-6个月内使用。

注意事项:

对于订购后可能放置较长时间后再使用的,或者对于检测结果的精度要求特别高的,推荐订购双萤光素酶报告基因检测试剂盒II (RG029);对于订购后短期内使用完毕的,推荐订购使用更加便捷的双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG027/RG028)。

加入海肾萤光素酶检测工作液后对于上一步骤中的萤火虫萤光素酶的抑制可以达到约99.9%以上。但总会残留微量活性,因此,宜在转染时把海肾萤光素酶的表达量控制在其RLU读数高于萤火虫萤光素酶RLU读数的10%。海肾萤光素酶的读数高于萤火虫萤光素酶的读数是完全可以的,通常不会有明显的负面影响。

本试剂盒的海肾萤光素酶检测缓冲液在反复冻融过程中,可能会导致检测试剂中出现少量沉淀,此时宜平衡至室温,并尽量溶解。如仍有残留的不溶物,混匀后直接使用,经测试通常不会影响后续的检测效果。

为取得最佳测定效果,在用单管的化学发光仪测定时,样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同的时间内,例如30秒内;使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时,宜先把样品全部加好,然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。

由于萤光素酶的活性对温度比较敏感,所以反应前样品和检测试剂均需达到室温后再进行测定。可将萤火虫萤光素酶检测缓冲液和海肾萤光素酶检测缓冲液在室温或不超过25℃的水浴中融解并混匀后再与对应的检测底物混合成检测试剂使用。

尽管经测试萤火虫萤光素酶检测缓冲液和检测底物混合后配制成的萤火虫萤光素酶检测试剂II反复冻融5次对其检测效果无明显影响,为保证萤火虫萤光素酶检测试剂的稳定性、取得良好的检测效果,建议现用现配。没有用完的检测试剂可以采取适当分装后避光保存的方法,以避免反复冻融和长时间暴露于室温。

样品和测定试剂混合后,必须等待1-2秒,再进行测定。测定时间通常为10秒,根据情况也可以测定更长或更短时间,但是同一批样品宜使用相同的测定时间。

检测时需使用白色或黑色的96孔板。如果使用普通透明的96孔板,相邻孔之间会产生相互干扰。推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)或BeyoGold™全白96孔细胞培养板(FCP968)。

RG027-4 海肾萤光素酶检测底物(100X)配制在无水乙醇中。由于无水乙醇容易挥发,有时会在初次使用时发现体积明显小于100µl的情况,此时用无水乙醇把体积补足至100µl,并混匀后即可使用。

海肾萤光素酶检测工作液宜配制后立即使用。如不能立即使用,-20℃可以保存一周。随着保存时间的延长检测效果会不断下降,因此不可配制成工作液后长期保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放II于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 裂解细胞:将报告基因细胞裂解液充分混匀后,按如下方式加入报告基因细胞裂解液,充分裂解细胞。
a. 对于贴壁细胞:吸尽细胞培养液后,参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液;对于悬浮细胞:离心去上清后,参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

器皿类型 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板
报告基因细胞裂解液(μl/孔) 100 150 200 300 500

注:如果萤光素酶的表达水平比较低,可以尝试使用更少的裂解液,例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。
b. 充分裂解后,10,000-15,000×g离心3-5分钟,取上清用于测定。
注:细胞裂解后可以立即测定萤光素酶,也可以先冻存,待以后再测定。冻存样品需融解,并达到室温后再进行测定。
2. 融解萤火虫萤光素酶检测缓冲液和海肾萤光素酶检测缓冲液,并达到室温。将萤火虫萤光素酶检测缓冲液全部转移至萤火虫萤光素酶检测底物瓶中,旋紧瓶盖后适当颠倒混匀,当检测底物全部溶解并混匀后即为萤火虫萤光素酶检测试剂II。海肾萤光素酶检测底物(100X)置于冰浴或冰盒上备用。注:冻干粉状的萤火虫萤光素酶检测底物可能会有少量粘附在瓶盖和瓶口,旋开瓶盖前可以拿起瓶子用瓶底并轻轻敲击桌面,使粉末尽量掉落至瓶底,然后再轻轻旋开瓶盖,并注意不要损失冻干粉。
3. 按照每个样品需100微升的量,取适量海肾萤光素酶检测缓冲液,按照1:100加入海肾萤光素酶检测底物(100X)配制成海肾萤光素酶检测工作液。例如,1毫升海肾萤光素酶检测缓冲液中加入10微升海肾萤光素酶检测底物(100X)充分混匀后即可配制成约1毫升海肾萤光素酶检测工作液。
4. 按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪,可以将测定间隔设为2秒,测定时间设为10秒,或者根据仪器设备的要求并根据实验需要设置适当的间隔时间和测定时间。
5. 每个样品测定时,取样品20-100微升(如果样品量足够,请加入100微升;如果样品量不足可以适当减少用量,但同批样品的使用量宜保持一致),取等体积的报告基因细胞裂解液作为空白对照。
6. 加入100微升萤火虫萤光素酶检测试剂II,用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU (relative light unit)。
7. 在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后,加入100微升海肾萤光素酶检测工作液,用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU (relative light unit)。本试剂盒的检测效果可以参考图1。
8. 在以海肾萤光素酶为内参的情况下,用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参,也可以进行类似计算。

常见问题:
1. Luminometer和荧光分光光度计有何不同?
荧光分光光度计检测的样品本身不能发光,样品需要由特定波长的激发光激发,然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光,不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。 有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能,即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
2. 可以进行ATP化学发光检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测?
是。ATP化学发光的检测原理和本试剂盒的原理相同,可以用相同的仪器测定。

参考文献:
1. J R de Wet, K V Wood, M DeLuca, D R Helinski, and S Subramani. Mol Cell Biol. 1987. 7:725-37.
2. Matthews J C, Hori K, Cormier M J. Biochemistry. 1977. 16(1):85-91.
3. E Schenborn, D Groskreutz. Mol Biotechnol. 1999. 13:29-44.

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双萤光素酶报告基因检测试剂盒II(RG029M)
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